Растительные и патогенные материалы
Картирование популяции ассоциаций сорго, известной как конверсионная популяция сорго (SCP), было предоставлено доктором Пэтом Брауном из Университета Иллинойса (сейчас в Калифорнийском университете в Дэвисе).Он был описан ранее и представляет собой коллекцию разнообразных линий, преобразованных в нечувствительность к фотопериоду и меньший рост, чтобы облегчить рост и развитие растений в условиях США.В этом исследовании было использовано 510 линий из этой популяции, хотя из-за плохой всхожести и других проблем контроля качества не все линии были использованы при анализе всех трех признаков.В конечном итоге для анализа ответа на хитин были использованы данные 345 линий, ответа flg22 - 472 линий и устойчивости к TLS - 456 линий.Б. КукейШтамм LSLP18 был получен от доктора Берта Блюма из Университета Арканзаса.
Измерение ответа MAMP
В этом исследовании использовались два разных MAMP: flg22 (каталог Genscript № RP19986) и хитин.Растения сорго выращивали во вкладышах, уложенных на ровных поверхностях, заполненных почвой (33% смеси для выращивания Sunshine Redi-Earth Pro) в теплице.Растения поливали за день до отбора проб, чтобы избежать повышенной влажности листьев в день отбора.
Линии были рандомизированы и по логистическим причинам были посажены партиями по 60 линий.Для каждой линии было посажено три «горшка» по два семени в каждой линии.Последующие партии высаживали, как только предыдущая партия была обработана, до тех пор, пока не была оценена вся популяция.Для обоих MAMP были проведены две экспериментальные серии с повторной рандомизацией генотипов в каждой из двух серий.
Анализы ROS проводили, как описано ранее.Вкратце, для каждой линии шесть семян были посажены в 3 разных горшка.Из полученных сеянцев по однородности отобрали три.Саженцы, которые выглядели необычно или были значительно выше или ниже большинства, не использовались.Четыре листовых диска диаметром 3 мм вырезали из самой широкой части 4-го листа трех разных 15-дневных растений сорго.Один диск на лист от двух растений и два диска от одного растения, причем второй диск служит для контроля воды (см. ниже).Диски по отдельности помещали в 50 мкл H2O в черный 96-луночный планшет, закрывали алюминиевой пломбой во избежание воздействия света и хранили при комнатной температуре в течение ночи.На следующее утро готовили реакционный раствор с использованием 2 мг/мл хемилюминесцентного зонда L-012 (Wako, номер по каталогу 120-04891), 2 мг/мл пероксидазы хрена (Тип VI-A, Sigma-Aldrich, номер по каталогу P6782) и 100 мг/мл хитина или 2 мкМ Flg22.По 50 мкл этого реакционного раствора добавляли в три из четырех лунок.Четвертая лунка представляла собой имитацию контроля, в которую добавляли реакционный раствор, за исключением MAMP.В каждый планшет также были включены четыре пустые лунки, содержащие только воду.
После добавления реакционного раствора люминесценцию измеряли с помощью мультидетектирующего микропланшет-ридера SynergyTM 2 (BioTek) каждые 2 минуты в течение 1 часа.Устройство для считывания пластин проводит измерения люминесценции каждые 2 минуты в течение этого 1 часа.Сумма всех 31 показаний была рассчитана для получения значения для каждой лунки.Оценочное значение ответа MAMP для каждого генотипа рассчитывали как (среднее значение люминесценции трех экспериментальных лунок - значение имитации лунки) минус среднее значение пустой лунки.Значения холостых лунок постоянно были близки к нулю.
Листовые диски изНикотиана Бентамиана, одну высокочувствительную линию сорго (SC0003) и одну низкочувствительную линию сорго (PI 6069) также включали в качестве контроля в каждый 96-луночный планшет для целей контроля качества.
Б. Кукейподготовка инокулята и прививка
Б. КукейИнокулят готовили, как описано ранее.Вкратце, зерна сорго замачивали в воде в течение трех дней, промывали, помещали в конические колбы объемом 1 л и автоклавировали в течение часа при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм и температуре 121 °C.Затем зерна инокулировали примерно 5 мл мацерированного мицелия из свежей культурыБ. КукейLSLP18 изолируют и оставляют на 2 недели при комнатной температуре, встряхивая колбы каждые 3 дня.Через 2 недели зараженные грибком зерна сорго сушили на воздухе, а затем хранили при температуре 4°C до полевой инокуляции.На протяжении всего испытания использовался один и тот же инокулят, который каждый год готовили свежим.Для инокуляции 6–10 зараженных зерен помещали в мутовку 4–5-недельных растений сорго.Споры этих грибов инициировали заражение молодых растений сорго в течение недели.
Подготовка семян
Перед посадкой в поле семена сорго обрабатывали смесью фунгицидов, инсектицидов и протравителей, содержащей ~ 1 % фунгицида Спирато 480 FS, 4 % фунгицида Себринг 480 FS, 3 % протравителя семян Сорпро 940 ES.Затем семена сушили на воздухе в течение 3 дней, что обеспечивало тонкое покрытие этой смеси вокруг семян.Антидождь позволил использовать гербицид Дуал Магнум в качестве довсходовой обработки.
Оценка устойчивости к целевой пятнистости листьев
SCP был посажен на Центральной исследовательской станции сельскохозяйственных культур в Клейтоне, Северная Каролина, 14–15 июня 2017 г. и 20 июня 2018 г. в рандомизированной полной блочной схеме с двумя экспериментальными повторениями в каждом случае.В экспериментах посеяли одинарными рядами шириной 1,8 м и шириной междурядий 0,9 м, используя 10 семян на делянку.По периферии каждого эксперимента были высажены два бордюрных ряда, чтобы предотвратить краевые эффекты.Эксперименты были инокулированы 20 июля 2017 г. и 20 июля 2018 г., когда растения сорго находились на стадии роста 3. Оценки принимались по шкале от одного до девяти, где растения, не показавшие признаков заболевания, оценивались как девять и полностью мертвые растения оценивались как одно.Два рейтинга были взяты в 2017 году и четыре чтения в 2018 году, начиная через две недели после прививки каждый год.sAUDPC (стандартизованная площадь под кривой прогрессирования заболевания) рассчитывали, как описано ранее.
Время публикации: 01 апреля 2021 г.