Растительные и патогенные материалы
Ассоциативная популяция сорго, известная как популяция конверсии сорго (SCP), была предоставлена доктором Пэтом Брауном из Иллинойсского университета (сейчас в Калифорнийском университете в Дэвисе). Она была описана ранее и представляет собой набор разнообразных линий, преобразованных в нечувствительность к фотопериоду и меньший рост для облегчения роста и развития растений в условиях США. В этом исследовании было использовано 510 линий из этой популяции, хотя из-за плохой всхожести и других проблем с контролем качества не все линии использовались в анализе всех трех признаков. В конечном итоге данные из 345 линий были использованы для анализа реакции хитина, 472 линий для реакции flg22 и 456 линий для устойчивости к TLS.B. кукиШтамм LSLP18 был получен от доктора Берта Блюма из Университета Арканзаса.
Измерение реакции MAMP
В этом исследовании использовались два разных MAMPs flg22 (каталожный номер Genscript RP19986) и хитин. Растения сорго выращивались в вставках, уложенных на плоскостях, заполненных почвой (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) в теплице. Растения поливали за день до сбора образцов, чтобы избежать излишней влажности листьев в день сбора.
Линии были рандомизированы и, по логистическим причинам, высаживались партиями по 60 линий. Для каждой линии высаживалось три «горшка» с двумя семенами на линию. Последующие партии высаживались сразу после обработки предыдущей партии, пока не была оценена вся популяция. Для обоих MAMPs было проведено два экспериментальных запуска с генотипами, повторно рандомизированными в каждом из двух запусков.
Анализы ROS проводились, как описано ранее. Вкратце, для каждой линии шесть семян были высажены в 3 разных горшка. Из полученных сеянцев три были отобраны на основе однородности. Саженцы, которые выглядели необычно или были значительно выше или ниже большинства, не использовались. Четыре листовых диска диаметром 3 мм были вырезаны из самой широкой части 4-го листа трех разных 15-дневных растений сорго. По одному диску на лист от двух растений и два диска от одного растения, причем второй диск стал контролем воды (см. ниже). Диски по отдельности плавали в 50 мкл H20 в черном 96-луночном планшете, запечатанном алюминиевой крышкой, чтобы избежать воздействия света, и оставленном при комнатной температуре на ночь. На следующее утро был приготовлен реакционный раствор с использованием 2 мг/мл хемилюминесцентного зонда L-012 (Wako, каталожный номер 120-04891), 2 мг/мл пероксидазы хрена (тип VI-A, Sigma-Aldrich, каталожный номер P6782) и 100 мг/мл хитина или 2 мкМ Flg22. 50 мкл этого реакционного раствора было добавлено в три из четырех лунок. Четвертая лунка была имитацией контроля, в которую был добавлен реакционный раствор, исключающий MAMP. Четыре пустых лунки, содержащие только воду, были также включены в каждую пластину.
После добавления реакционного раствора люминесценцию измеряли с помощью многофункционального ридера для микропланшетов SynergyTM 2 (BioTek) каждые 2 мин в течение 1 ч. Ридер для планшетов производит измерения люминесценции каждые 2 мин в течение этого 1 ч. Сумма всех 31 показаний была рассчитана для получения значения для каждой лунки. Оценочное значение для ответа MAMP для каждого генотипа было рассчитано как (среднее значение люминесценции трех экспериментальных лунок — значение ложной лунки) — минус среднее значение пустой лунки. Значения пустой лунки были последовательно близки к нулю.
Листовые дискиНикотиана бентамианскаяодна высокочувствительная линия сорго (SC0003) и одна низкочувствительная линия сорго (PI 6069) также были включены в качестве контролей в каждый 96-луночный планшет для целей контроля качества.
B. кукиПодготовка инокулята и инокуляция
B. кукиИнокулят был приготовлен, как описано ранее. Вкратце, зерна сорго были замочены в воде на три дня, промыты, собраны в конические колбы объемом 1 л и автоклавированы в течение часа при 15 фунтах на кв. дюйм и 121 °C. Затем зерна были инокулированы примерно 5 мл мацерированного мицелия из свежей культурыB. кукиLSLP18 изолируют и оставляют на 2 недели при комнатной температуре, встряхивая колбы каждые 3 дня. Через 2 недели зараженные грибком зерна сорго высушивают на воздухе, а затем хранят при температуре 4 °C до полевой инокуляции. Один и тот же инокулят используют для всего испытания и готовят свежий каждый год. Для инокуляции 6–10 зараженных зерен помещают в мутовку 4–5-недельных растений сорго. Споры, полученные от этих грибков, инициируют инфекцию молодых растений сорго в течение недели.
Подготовка семян
Перед посадкой в поле семена сорго обрабатывались смесью фунгицида, инсектицида и антидота, содержащей ~ 1% фунгицида Spirato 480 FS, 4% фунгицида Sebring 480 FS, 3% антидота для семян Sorpro 940 ES. Затем семена высушивались на воздухе в течение 3 дней, что обеспечивало тонкое покрытие этой смесью вокруг семян. Антидот позволял использовать гербицид Dual Magnum в качестве довсходовой обработки.
Оценка устойчивости к листовой пятнистости
SCP был посажен на Центральной станции исследований сельскохозяйственных культур в Клейтоне, Северная Каролина, 14–15 июня 2017 года и 20 июня 2018 года в рандомизированном полном блочном дизайне с двумя экспериментальными повторениями в каждом случае. Эксперименты были посажены в одиночные ряды 1,8 м с шириной ряда 0,9 м с использованием 10 семян на участок. Два пограничных ряда были посажены по периферии каждого эксперимента, чтобы предотвратить краевые эффекты. Эксперименты были инокулированы 20 июля 2017 года и 20 июля 2018 года, когда растения сорго находились на стадии роста 3. Оценки проводились по шкале от одного до девяти, где растения, не показывающие признаков болезни, оценивались как девять, а полностью мертвые растения оценивались как один. Две оценки были получены в 2017 году и четыре показания в 2018 году, начиная с двух недель после инокуляции каждый год. sAUDPC (стандартизированная площадь под кривой прогрессирования заболевания) рассчитывалась, как описано ранее.
Время публикации: 01.04.2021