Растительные и патогенные материалы
Популяция для картирования ассоциации сорго, известная как популяция конверсии сорго (SCP), была предоставлена доктором Пэт Браун из Университета Иллинойса (в настоящее время в Калифорнийском университете в Дэвисе). Она была описана ранее и представляет собой коллекцию различных линий, преобразованных в нечувствительную к фотопериоду и уменьшенную в размерах для облегчения роста и развития растений в условиях США. В данном исследовании было использовано 510 линий из этой популяции, хотя из-за плохой всхожести и других проблем с контролем качества не все линии были использованы для анализа всех трех признаков. В конечном итоге данные 345 линий были использованы для анализа реакции на хитин, 472 линии — для реакции на flg22 и 456 — для устойчивости к TLS.Б. КукейШтамм LSLP18 был получен от доктора Берта Блюма из Университета Арканзаса.
измерение реакции MAMP
В этом исследовании использовались два разных MAMP: flg22 (каталожный номер Genscript RP19986) и хитин. Растения сорго выращивали в теплице в контейнерах, размещенных на лотках, заполненных почвой (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix). Растения поливали за день до сбора образцов, чтобы избежать избыточной влажности листьев в день сбора.
Линии были рандомизированы и, по логистическим соображениям, высаживались партиями по 60 линий. Для каждой линии было высажено три «горшка» по два семени. Последующие партии высаживались сразу после обработки предыдущей партии, пока не была оценена вся популяция. Для обоих MAMP было проведено два экспериментальных цикла, в каждом из которых генотипы были повторно рандомизированы.
Анализ активности активных форм кислорода (ROS) проводился, как описано ранее. Вкратце, для каждой линии шесть семян высаживали в 3 разных горшка. Из полученных сеянцев отбирали три на основе однородности. Сеянцы, которые выглядели необычно или были значительно выше или ниже большинства, не использовались. Четыре листовых диска диаметром 3 мм вырезали из самой широкой части 4-го листа трех разных 15-дневных растений сорго. По одному диску с каждого листа от двух растений и два диска от одного растения, причем второй диск становился контролем по воде (см. ниже). Диски помещали по отдельности в 50 мкл H2O в черном 96-луночном планшете, герметизировали алюминиевой пломбой, чтобы избежать воздействия света, и оставляли при комнатной температуре на ночь. На следующее утро был приготовлен реакционный раствор с использованием 2 мг/мл хемилюминесцентного зонда L-012 (Wako, каталожный номер 120-04891), 2 мг/мл пероксидазы хрена (тип VI-A, Sigma-Aldrich, каталожный номер P6782) и 100 мг/мл хитина или 2 мкМ Flg22. 50 мкл этого реакционного раствора добавляли в три из четырех лунок. Четвертая лунка служила контрольной, в которую добавляли реакционный раствор без MAMP. В каждую планшету также включали четыре пустые лунки, содержащие только воду.
После добавления реакционного раствора люминесценцию измеряли с помощью многоканального микропланшетного ридера Synergy™ 2 (BioTek) каждые 2 минуты в течение 1 часа. Измерение люминесценции проводилось каждые 2 минуты в течение этого часа. Сумма всех 31 показаний рассчитывалась для получения значения для каждой лунки. Оценочное значение ответа MAMP для каждого генотипа рассчитывалось как (среднее значение люминесценции трех экспериментальных лунок - значение контрольной лунки) - минус среднее значение контрольной лунки. Значения контрольной лунки были постоянно близки к нулю.
Листовые диски изNicotiana benthamianaДля контроля качества в каждую 96-луночную планшету также были включены одна высокочувствительная линия сорго (SC0003) и одна низкочувствительная линия сорго (PI 6069).
Б. КукейПодготовка инокулята и инокуляция
Б. КукейИнокулят готовили, как описано ранее. Вкратце, зерна сорго замачивали в воде в течение трех дней, промывали, помещали в конические колбы объемом 1 л и автоклавировали в течение часа при давлении 15 psi и температуре 121 °C. Затем зерна инокулировали примерно 5 мл мацерированного мицелия из свежей культурыБ. КукейИзоляты LSLP18 оставляли на 2 недели при комнатной температуре, встряхивая колбы каждые 3 дня. Через 2 недели зараженные грибом зерна сорго высушивали на воздухе, а затем хранили при 4 °C до полевой инокуляции. Для всего эксперимента использовали один и тот же инокулят, который готовили заново каждый год. Для инокуляции 6–10 зараженных зерен помещали в розетку 4–5-недельных растений сорго. Споры, продуцируемые этими грибами, инициировали заражение молодых растений сорго в течение недели.
Подготовка семян
Перед посадкой в поле семена сорго обрабатывали смесью фунгицида, инсектицида и антидота, содержащей примерно 1% фунгицида Spirato 480 FS, 4% фунгицида Sebring 480 FS и 3% антидота Sorpro 940 ES. Затем семена сушили на воздухе в течение 3 дней, что обеспечивало тонкое покрытие этой смесью вокруг семян. Антидот позволил использовать гербицид Dual Magnum в качестве предпосевной обработки.
Оценка устойчивости к пятнистости листьев.
Экспериментальный образец сорго (SCP) был высажен на Центральной научно-исследовательской станции сельскохозяйственных культур в Клейтоне, Северная Каролина, 14–15 июня 2017 года и 20 июня 2018 года в соответствии с рандомизированным полным блочным дизайном с двумя экспериментальными повторениями в каждом случае. Посев производился в один ряд шириной 1,8 м и шириной междурядий 0,9 м, по 10 семян на участок. По периметру каждого эксперимента были высажены два крайних ряда для предотвращения краевых эффектов. Инокуляция проводилась 20 июля 2017 года и 20 июля 2018 года, когда растения сорго находились на 3-й стадии роста. Оценка проводилась по шкале от одного до девяти, где растения, не проявляющие признаков заболевания, оценивались в девять баллов, а полностью погибшие растения — в один балл. В 2017 году проводилось две оценки, а в 2018 году — четыре, начиная через две недели после инокуляции каждого года. sAUDPC (стандартизированная площадь под кривой прогрессирования заболевания) рассчитывалась, как описано ранее.
Дата публикации: 01.04.2021