Растительные и патогенные материалы
Популяция ассоциативного картирования сорго, известная как популяция конверсии сорго (SCP), была предоставлена доктором Пэт Браун из Иллинойсского университета (ныне Калифорнийский университет в Дэвисе). Она была описана ранее и представляет собой набор разнообразных линий, преобразованных в нечувствительные к фотопериоду и низкорослые растения для облегчения роста и развития растений в условиях США. В данном исследовании были использованы 510 линий из этой популяции, хотя из-за плохой всхожести и других проблем с контролем качества не все линии были использованы для анализа всех трёх признаков. В конечном итоге данные по 345 линиям были использованы для анализа хитинового ответа, по 472 линиям – для анализа ответа flg22 и по 456 линиям – для анализа устойчивости к TLS.B. cookieiШтамм LSLP18 был получен от доктора Берта Блюма из Университета Арканзаса.
Измерение ответа MAMP
В данном исследовании использовались два различных MAMP: flg22 (каталожный номер Genscript RP19986) и хитин. Растения сорго выращивали в теплице в ячейках, заполненных почвой (33% смеси Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix). Растения поливали за день до сбора образцов, чтобы избежать излишней влажности листьев в день сбора.
Линии были рандомизированы и, по логистическим причинам, высажены партиями по 60 штук. Для каждой линии было высажено три «горшка» с двумя семенами в каждой. Последующие партии высаживались сразу после обработки предыдущей, пока не была оценена вся популяция. Для обоих MAMP было проведено два экспериментальных цикла с повторной рандомизацией генотипов в каждом из двух циклов.
Анализы на ROS проводились, как описано ранее. Вкратце, для каждой линии шесть семян были высажены в три разных горшка. Из полученных сеянцев были отобраны три на основе однородности. Сеянцы, которые выглядели необычно или были значительно выше или ниже большинства, не использовались. Четыре листовых диска диаметром 3 мм были вырезаны из самой широкой части 4-го листа трёх разных 15-дневных растений сорго. По одному диску на лист от двух растений и два диска от одного растения, причём второй диск служил контролем воды (см. ниже). Диски по отдельности помещали в 50 мкл H2O в чёрный 96-луночный планшет, запечатанный алюминиевой крышкой для защиты от воздействия света, и оставляли при комнатной температуре на ночь. На следующее утро был приготовлен реакционный раствор с использованием хемилюминесцентного зонда L-012 (Wako, каталожный номер 120-04891) с концентрацией 2 мг/мл, пероксидазы хрена (тип VI-A, Sigma-Aldrich, каталожный номер P6782) и хитина (100 мг/мл) или 2 мкМ Flg22. 50 мкл этого реакционного раствора добавляли в три из четырёх лунок. Четвёртая лунка служила контрольной, в неё добавляли реакционный раствор без MAMP. В каждый планшет также были включены четыре пустые лунки, содержащие только воду.
После добавления реакционного раствора люминесценцию измеряли с помощью многофункционального планшетного ридера SynergyTM 2 (BioTek) каждые 2 минуты в течение 1 часа. Считыватель измерял люминесценцию каждые 2 минуты в течение этого часа. Сумма всех 31 показаний рассчитывалась для получения значения для каждой лунки. Оценочное значение ответа MAMP для каждого генотипа рассчитывалось как (среднее значение люминесценции трёх экспериментальных лунок – значение для ложной лунки) – минус среднее значение для пустой лунки. Значения для пустой лунки были стабильно близки к нулю.
Листовые дискиNicotiana benthamianaодна высокочувствительная линия сорго (SC0003) и одна низкочувствительная линия сорго (PI 6069) также были включены в качестве контролей в каждый 96-луночный планшет для целей контроля качества.
B. cookieiприготовление инокулята и инокуляция
B. cookieiИнокулят был приготовлен, как описано ранее. Вкратце, зёрна сорго замачивали в воде в течение трёх дней, промывали, помещали в конические колбы объёмом 1 л и автоклавировали в течение часа при давлении 15 фунтов на кв. дюйм и температуре 121 °C. Затем зёрна инокулировали примерно 5 мл мацерированного мицелия из свежей культурыB. cookieiИзоляты LSLP18 оставляли на 2 недели при комнатной температуре, встряхивая колбы каждые 3 дня. Через 2 недели зараженные грибом зерна сорго высушивали на воздухе и хранили при температуре 4 °C до полевой инокуляции. Для всего эксперимента использовали один и тот же инокулят, который готовили каждый год. Для инокуляции 6–10 зараженных зерен помещали в мутовки 4–5-недельных растений сорго. Споры, полученные от этих грибов, вызывали заражение молодых растений сорго в течение недели.
Подготовка семян
Перед посадкой в поле семена сорго обрабатывали смесью фунгицида, инсектицида и антидота, содержащей ~ 1% фунгицида Spirato 480 FS, 4% фунгицида Sebring 480 FS и 3% антидота Sorpro 940 ES. Затем семена подсушивали на воздухе в течение 3 дней, что обеспечивало тонкий слой этой смеси вокруг семян. Антидот позволил использовать гербицид Dual Magnum для довсходовой обработки.
Оценка устойчивости к целевой пятнистости листьев
SCP был посажен на Центральной станции исследований сельскохозяйственных культур в Клейтоне, штат Северная Каролина, 14–15 июня 2017 года и 20 июня 2018 года по рандомизированному полному блочному плану с двумя экспериментальными повторениями в каждом случае. Эксперименты были посажены в отдельные ряды 1,8 м с шириной междурядья 0,9 м с использованием 10 семян на делянку. Два пограничных ряда были высажены по периферии каждого эксперимента, чтобы предотвратить краевые эффекты. Эксперименты были инокуляции 20 июля 2017 года и 20 июля 2018 года, в этот момент растения сорго находились на стадии роста 3. Оценки выставлялись по шкале от одного до девяти, где растения, не показывающие признаков болезни, оценивались как девять, а полностью мертвые растения оценивались как один. Две оценки были взяты в 2017 году и четыре показания в 2018 году, начиная со второй недели после инокуляции каждый год. sAUDPC (стандартизированная площадь под кривой прогрессирования заболевания) рассчитывалась, как описано ранее.
Время публикации: 01.04.2021