Пестициды играют решающую роль в решении проблемы глобального дефицита продовольствия и борьбе с болезнями человека, передаваемыми переносчиками. Однако растущая проблема устойчивости к пестицидам срочно требует открытия новых соединений, нацеленных на недостаточно используемые мишени. Каналы транзиторного рецепторного потенциала (TRPV) насекомых — Наньчжун (Nan) и неактивный (Iav) — могут образовывать гетерологичные каналы (Nan-Iav) и локализоваться в механосенсорных органах, которые обеспечивают геотропизм, слух и проприоцепцию у насекомых. Некоторые пестициды, такие как афидопирролидон (AP), воздействуют на Nan-Iav посредством неизвестных механизмов. AP эффективен против сосущих насекомых (полужесткокрылых), предотвращая питание за счет нарушения функции филаментов. AP может связываться только с Nan, но только Nan-Iav может взаимодействовать с агонистами, включая эндогенный никотинамид (NAM), тем самым проявляя активность канала. Несмотря на потенциал Nan-Iav в качестве мишени для инсектицидов, мало что известно о его канальной сборке, регуляторных сайтах связывания и Ca2+-зависимой регуляции, что препятствует дальнейшей разработке инсектицидов. В этом исследовании с помощью криоэлектронной микроскопии была определена структура Nan-Iav у насекомых отряда Hemiptera в состоянии без лиганда кальмодулина, а также с AP и NAM на границе цитоплазматического домена анкириновых повторов (ARD). Удивительно, но мы обнаружили, что сам белок Nan может образовывать пентамер, который стабилизируется опосредованными AP взаимодействиями ARD. Это исследование раскрывает молекулярные взаимодействия между инсектицидами и агонистами и Nan-Iav, подчеркивая важность ARD в функционировании и сборке канала, а также исследуя механизм регуляции Ca2+.
На фоне усиливающихся глобальных изменений климата ухудшение глобальной продовольственной безопасности является одной из главных проблем XXI века, имеющей каскадные последствия для общества.1,2В докладе Всемирной организации здравоохранения «Состояние продовольственной безопасности и питания в мире 2023» (SOFI) оценивается, что примерно 2,33 миллиарда человек во всем мире страдают от умеренной или тяжелой нехватки продовольствия, что является давней проблемой.3,4К сожалению, по оценкам, ежегодно от вредителей и болезнетворных микроорганизмов теряется от 20% до 30% и более урожая, а глобальное потепление, как ожидается, усугубит устойчивость вредителей и уязвимость сельскохозяйственных культур.4,5,6,7,8Разработка пестицидов имеет решающее значение не только для защиты сельскохозяйственных культур от вредителей и снижения распространения переносимых насекомыми патогенов, но и для борьбы с переносимыми насекомыми-переносчиками таких заболеваний человека, как лихорадка денге, малярия и болезнь Шагаса, которые становятся все более устойчивыми к пестицидам.5,9,10,11
Среди основных мишеней нейротоксичных инсектицидов гетеротетрамерный TRPV-канал Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) представляет собой класс мишеней инсектицидов, обнаруженных только в последнее десятилетие, включая коммерчески доступные инсектициды, такие как имидаклоприд и пираклостробин.12,13,14Полусинтетический инсектицид афидопирролифен (АП) — это недавно разработанный и коммерциализированный продукт, основным компонентом которого является активный инсектицид Inscalis®, связывающий АП на уровне субнаномолярной активности.15АП обладает низкой острой токсичностью для опылителей, полезных насекомых и других нецелевых организмов, а при использовании в соответствии с инструкцией на этикетке может снижать устойчивость к другим инсектицидам.16,17,18Гены Nan и Iav широко распространены среди видов насекомых, совместно экспрессируются только в хордальных рецепторных нейронах усиков и конечностей и имеют решающее значение для слуха, восприятия гравитации и проприоцепции.13,16,19,20,21,22АП, имидаклоприд и пираклостробин стимулируют комплекс Nan-Iav посредством уникального механизма, в конечном итоге подавляя передачу проприоцептивных сигналов.13,16,23У насекомых, прокалывающих и сосущих насекомых (полукрылых), таких как тля и белокрылка, потеря проприоцепции ухудшает их способность к питанию, что в конечном итоге приводит к смерти.13,24Интересно, что AP проявляет высокое сродство к комплексу Nan-Iav и низкое сродство к одному только Nan. Связывание AP с Nan-Iav вызывает электрический ток, но связывание только с Nan не стимулирует активность канала. Сам Iav вообще не связывается с AP.16Это позволяет предположить, что Nan и Iav могут связываться, образуя различные комплексы каналов Nan-Iav (например, с различными стехиометрическими соотношениями или различным расположением в пределах одного и того же стехиометрического соотношения), или что AP может связываться с несколькими участками. Кроме того, природный агонист никотинамид (NAM) связывается с Nan-Iav дрозофилы с микромолярной аффинностью, проявляя эффекты, аналогичные эффектам тлей (AP) in vitro.16,25а также подавляет размножение и питание тлей, что в конечном итоге приводит к их гибели.25,26Эти данные вызывают множество вопросов. Например, остается неясным, как образуется гетеродимер Nan-Iav, какие сайты связывания используются для модуляции малых молекул и как эти малые молекулы регулируют функцию канала, подавляя проприоцепцию. Кроме того, остаются неясными причины, по которым сам Nan неактивен и имеет низкое сродство к AP, в то время как гетеродимер Nan-Iav активен и связывает AP с более высоким сродством. Наконец, мало что известно о Ca2+-зависимой регуляции функции Nan-Iav и о том, как она интегрируется в нейронные сигнальные процессы.. 13,21
В этом исследовании, сочетая криоэлектронную микроскопию, электрофизиологию и методы радиолигандного связывания, мы изучили сборку Nan-Iav и механизм его связывания с регуляторами малых молекул. Кроме того, мы обнаружили конститутивно связанный кальмодулин (CaM) с Iav и стабилизированными AP пентамерами Nan. Эти результаты дают важное представление о регуляции ионов кальция в каналах, сборке каналов и факторах, определяющих сродство связывания лиганда. Что еще более важно, мы подтвердили, что ARD играет центральную роль в этих процессах. Наше исследование полных каналов насекомых, связанных с соответствующими сельскохозяйственными пестицидами,27, 28, 29Это открывает перспективы для развития индустрии пестицидов, повышения эффективности и специфичности пестицидов, а также позволяет применять соединения, нацеленные на TRPV, к другим видам животных для решения проблем глобальной продовольственной безопасности и распространения болезней, передаваемых переносчиками.
Мы также обнаружили, что Nan-Iav регулируется ионами Ca2+, и механизм регуляции опосредуется конститутивно связанным CaM. Важно отметить, что эта Ca2+-зависимая регуляция Nav с помощью CaM значительно отличается от механизмов регуляции других ионных каналов (например, потенциал-зависимых Na+ каналов и каналов TRPV5/6).52,53,54,55,56,57В канале Nav1.2 С-концевой домен CaM спирально связывается с С-концевым доменом (CTD), и Ca2+ индуцирует связывание его N-концевого домена с дистальной частью CTD.56В канале TRPV5/6 С-концевой домен CaM связывается с CTH, и Ca2+ вызывает вытягивание его N-концевого домена вверх в пору, тем самым блокируя проницаемость для катионов.53,54Мы предлагаем модель для Ca2+-регулируемой функции Nan-Iav-CaM (рис. 4h). В этой модели N-концевой домен CaM конститутивно связывается с C-концевым доменом (CTH) Iav. В состоянии покоя (низкая концентрация [Ca2+]) C-концевой домен CaM взаимодействует с Nan, стабилизируя конформацию ARD и тем самым способствуя открытию канала. Связывание агониста/инсектицида с каналом вызывает открытие поры, приводящее к притоку Ca2+. Затем Ca2+ связывается с CaM, вызывая диссоциацию C-концевого домена от ARD Nan. Поскольку блокирование связывания CaM по существу устраняет ингибирующее действие Ca2+, эта диссоциация модулирует подвижность ARD, вызывая тем самым Ca2+-зависимое ингибирование или десенсибилизацию. Быстрое восстановление токов каналов после элюции ионов кальция (рис. 4g) предполагает, что этот механизм способствует быстрой реакции на нейронные сигналы, опосредованные Ca2+. Кроме того, сообщалось, что С-концевой регион Iav, который остается малоизученным, играет и другие роли в направленном перемещении каналов и регуляции тока.21
Наконец, наше исследование представляет высокоразрешенную структуру комплекса инсектицид-инсектицидного TRP-канала, имеющего важное значение для сельского хозяйства — открытие, ранее нам неизвестное. Примечательно, что мы охарактеризовали структуру и функцию канала насекомых в клетках человека (HEK293S GnTi–), а не в клетках насекомых. В условиях растущей устойчивости к инсектицидам и постоянного давления на продовольственную безопасность и патогенные микроорганизмы, наша работа предоставляет важную информацию, которая будет способствовать разработке новых инсектицидов на благо здоровья человека и глобальной продовольственной безопасности. Исследования показали, что такие инсектициды, как АП, эффективны против некоторых вредителей при использовании в соответствии с инструкциями на этикетке и обладают низкой острой токсичностью для полезных опылителей, что демонстрирует их экологическую безопасность.13,16Кроме того, тестирование некоторых производных АП на комарах показало, что со временем они теряют способность летать. Понимание того, как эти модулирующие соединения связываются с Nan-Iav, позволит модифицировать существующие соединения или разработать новые соединения для повышения их эффективности.точныйБорьба с вредителями. Наше исследование демонстрирует, что интерфейс Nan-Iav ARD имеет решающее значение не только для регулирования активности эндогенных соединений, пестицидов и Ca2+-CaM, но и для сборки каналов. Мы предполагаем, что нарушение сборки гетеродимеров с помощью малых молекул может быть уникальным и многообещающим подходом к разработке ингибиторов ионных каналов.
Из восьми ортологичных генов были выбраны полноразмерные гены бурого жука (Halyomorpha halys) Nanchung и Inactive, демонстрирующие превосходную стабильность в детергентах. Синтезированные гены были оптимизированы по кодонам для экспрессии у человека и клонированы в вектор pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) с использованием сайтов рестрикции XhoI и EcoRI. Это гарантировало, что клоны находятся в рамке считывания с С-концевыми метками GFP-FLAG-10xHis и mCherry-FLAG-10xHis, которые расщепляются протеазой HRC-3C (PPX), что позволяет осуществлять независимую РНК-полимеразу.выражениеДля клонирования генов Nanchung и Inactive в вектор pBacMam использовались следующие праймеры:
Микроскопические изображения отдельных частиц были получены на просвечивающем электронном микроскопе Titan Krios G2 (FEI), оснащенном камерой K3 и энергетическим фильтром Gatan BioQuantum. Микроскоп работал при напряжении 300 кэВ, с настройкой энергии 20 эВ, размером пикселя образца 1,08 Å/пиксель (номинальное увеличение 81 000x) и градиентом дефокусировки в диапазоне от -0,8 до -2,2 мкм. Видеозапись проводилась со скоростью 40 кадров в секунду с использованием микроскопа Latitude S (Gatan) с номинальной мощностью дозы 25 е–пк−1 с−1, временем экспозиции 2,4 с и суммарной дозой приблизительно 60 е–Å−2.
Коррекция движения, вызванного пучком излучения, и взвешивание дозы выполнялись на пленке с использованием MotionCor2 в RELION 4.061. Оценка параметров функции передачи контраста (CTF) проводилась в cryoSPARC с использованием метода оценки CTF на основе патчей62. Фотомикрографии с разрешением подгонки CTF ≥4 Å исключались из последующего анализа. Как правило, для выбора точек в cryoSPARC использовалось подмножество из 500–1000 фотомикрографий, после чего проводилось несколько раундов 2D-классификации после фильтрации для получения четкого эталонного изображения для выбора частиц на основе шаблона. Затем частицы извлекались с использованием 64-пиксельных ограничивающих рамок и 4-кратного биннинга. Было выполнено несколько раундов 2D-классификации для удаления нежелательных категорий частиц. Начальная 3D-модель была реконструирована с использованием реконструкции ab initio и уточнена с использованием неравномерного уточнения в cryoSPARC. 3D-классификация проводилась в cryoSPARC или RELION на основе гетерогенности ARD. Значительной неоднородности мембранных доменов не наблюдалось. Частицы уточнялись с использованием методов C1 и C2; частицы с более высоким разрешением C2 считались симметричными относительно C2 и импортировались в RELION для байесовского уточнения. Затем частицы были перенесены обратно в cryoSPARC для окончательного неравномерного и локального уточнения. Окончательное разрешение и количество частиц показаны в таблице 1.
При обработке пентамеров Nan+AP мы исследовали различные методы повышения разрешения мембранных доменов (особенно области пор), такие как вычитание сигнала и маскирование TMD. Однако эти попытки оказались безуспешными из-за потенциально крайнего беспорядка в области пор и общей гетерогенности TMD. Окончательное разрешение было рассчитано с использованием маски, автоматически сгенерированной методом неравномерной обработки в cryoSPARC, в первую очередь нацеленной на область ARD. Это позволило достичь значительно более высокого разрешения, чем у мембранных доменов (особенно области VSLD).
Первоначальные модели апо-форм Nanchung и Inactive были созданы с помощью Coot63, а модели Nan и Iav — с помощью AlphaFold264 для идентификации областей с низкой степенью достоверности. Моделирование кальмодулина основывалось на подгонке жестких тел моделей связывания Ca2+ и моделей без Ca2+ в базах данных PDB под номерами 4JPZ56 и 1CFD65 соответственно. Модели были уточнены с использованием сферического уточнения для обеспечения правильной стереохимии и хорошей геометрии. Затем фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсерин были смоделированы как четко определенные липидные плотности, а лиганды NAM и AP были помещены в соответствующие плотности в плотных соединениях. Файлы ограничений были сгенерированы из строки SMILES изоформ с помощью eLBOW в PHENIX66. Наконец, модели были уточнены в реальном пространстве в программе PHENIX с использованием локального поиска по сетке и глобальной минимизации с учетом ограничений вторичной структуры. Для уточнения моделей и структурного анализа использовался сервер MolProbity, а иллюстрации были выполнены с помощью PyMOL и UCSF Chimera X. 67,68,69 Анализ апертуры проводился с использованием сервера HOLE,70 а картирование консервативности последовательности — с использованием сервера Consurf.71
Статистический анализ проводился с использованием Igor Pro 6.2, Excel Office 365 и GraphPad Prism 7.0. Все количественные данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка (СЭ). Для сравнения двух групп использовался t-критерий Стьюдента (двусторонний, непарный). Для сравнения нескольких групп использовался однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Даннетта. *P< 0,05, **P< 0,01 и ***PЗначения < 0,001 считались статистически значимыми в зависимости от распределения данных. Значения Kd, Ki и их асимметричные 95% доверительные интервалы были рассчитаны с помощью GraphPad Prism 10.
Более подробную информацию о методологии исследования можно найти в кратком отчете Nature Portfolio Report Summary, ссылка на который приведена в этой статье.
Первоначальная модель была построена с использованием моделей кальмодулина из баз данных PDB 4JPZ и 1CFD. Координаты депонированы в Банке данных белков (PDB) под номерами доступа 9NVN (Nan-Iav-CaM без лиганда), 9NVO (Nan-Iav-CaM, связанный с никотинамидом), 9NVP (Nan-Iav-CaM, связанный с никотинамидом и ЭДТА), 9NVQ (Nan-Iav-CaM, связанный с афенидолпирроллином и кальцием), 9NVR (Nan-Iav-CaM, связанный с афенидолпирроллином и ЭДТА) и 9NVS (пентамер Nan, связанный с афенидолпирроллином). Соответствующие изображения, полученные методом криоэлектронной микроскопии, депонированы в базе данных электронной микроскопии (EMDB) под следующими номерами доступа: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM без лиганда), EMD-49845 (комплекс Nan-Iav-CaM с никотинамидом), EMD-49846 (комплекс Nan-Iav-CaM с никотинамидом и ЭДТА), EMD-49847 (комплекс Nan-Iav-CaM с афидопирроллином и кальцием), EMD-49848 (комплекс Nan-Iav-CaM с афидопирроллином и ЭДТА) и EMD-49849 (пентамерный комплекс Nan с афидопирроллином). Исходные данные для функционального анализа представлены в данной статье.
Дата публикации: 28 января 2026 г.