Противоглистный препарат N,N-диэтил-м-толуамид (ДЭЭТСообщалось, что DEET ингибирует ацетилхолинэстеразу (АХЭ) и обладает потенциальными канцерогенными свойствами из-за чрезмерной васкуляризации. В данной работе мы показываем, что DEET специфически стимулирует эндотелиальные клетки, способствующие ангиогенезу, тем самым увеличивая рост опухоли. DEET активирует клеточные процессы, ведущие к ангиогенезу, включая пролиферацию, миграцию и адгезию. Это связано с увеличением продукции NO и экспрессии VEGF в эндотелиальных клетках. Подавление экспрессии M3 или использование фармакологических ингибиторов M3 устраняло все эти эффекты, что указывает на чувствительность ангиогенеза, индуцированного DEET, к M3. Эксперименты с использованием кальциевой сигнализации в эндотелиальных клетках и клетках HEK, сверхэкспрессирующих рецепторы M3, а также исследования связывания и докинга показывают, что DEET действует как аллостерический модулятор рецепторов M3. Кроме того, DEET ингибирует АХЭ, тем самым увеличивая биодоступность ацетилхолина и его связывание с рецепторами M3, а также усиливая проангиогенные эффекты посредством аллостерической регуляции.
Первичные эндотелиальные клетки были выделены из аорты швейцарских мышей. Метод экстракции был адаптирован из протокола Кобаяши 26. Мышиные эндотелиальные клетки культивировали в среде EBM-2, дополненной 5% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой, до четвертого пассажа.
Влияние двух концентраций DEET на пролиферацию клеток HUVEC, U87MG или BF16F10 анализировали с помощью набора для анализа пролиферации клеток CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Кратко, в 96-луночный планшет засевали 5·10³ клеток на лунку, давали им прикрепиться в течение ночи, а затем обрабатывали DEET в течение 24 часов. После удаления культуральной среды в каждую лунку микропланшета добавляли раствор для связывания красителя и инкубировали клетки при 37 °C в течение 30 минут. Уровни флуоресценции определяли с помощью многорежимного микропланшетного ридера Mithras LB940 (Berthold Technologies, Бад-Вильдбад, Германия), оснащенного фильтрами возбуждения 485 нм и фильтрами излучения 530 нм.
Клетки HUVEC высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 104 клетки на лунку. Клетки обрабатывали DEET в течение 24 часов. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью колориметрического MTT-анализа (Sigma-Aldrich, M5655). Значения оптической плотности получали на многорежимном микропланшетном ридере (Mithras LB940) при длине волны 570 нм.
Влияние ДЭЭТ изучалось с использованием анализов ангиогенеза in vitro. Обработка ДЭЭТ в концентрациях 10⁻⁸ М или 10⁻⁵ М увеличивала длину капилляров в клетках HUVEC (рис. 1a, b, белые столбцы). По сравнению с контрольной группой, обработка ДЭЭТ в концентрациях от 10⁻¹⁴ до 10⁻⁵ М показала, что длина капилляров достигала плато при концентрации ДЭЭТ 10⁻⁸ М (дополнительный рис. S2). Не было обнаружено существенной разницы в проангиогенном эффекте ДЭЭТ in vitro в клетках HUVEC, обработанных ДЭЭТ в диапазоне концентраций 10⁻⁸ М и 10⁻⁵ М.
Для определения влияния ДЭЭТ на неоваскуляризацию мы провели исследования неоваскуляризации in vivo. Через 14 дней у мышей, которым вводили эндотелиальные клетки, предварительно культивированные с 10⁻⁸ М или 10⁻⁵ М ДЭЭТ, наблюдалось значительное увеличение содержания гемоглобина (рис. 1с, белые столбцы).
Кроме того, неоваскуляризация, индуцированная ДЭЭТ, изучалась на мышах с ксенотрансплантатами U87MG, которым ежедневно (внутрибрюшинно) вводили ДЭЭТ в дозе, вызывающей концентрацию в плазме 10⁻⁵ М, что является нормой для людей, подвергшихся воздействию. 23. Обнаруживаемые опухоли (т.е. опухоли >100 мм³) наблюдались через 14 дней после инъекции клеток U87MG мышам. На 28-й день рост опухолей был значительно усилен у мышей, получавших ДЭЭТ, по сравнению с контрольными мышами (рис. 1d, квадраты). Кроме того, окрашивание опухолей CD31 показало, что ДЭЭТ значительно увеличивает площадь капилляров, но не плотность микрососудов (рис. 1e–g).
Для определения роли мускариновых рецепторов в пролиферации, индуцированной DETA, использовали 10⁻⁸ М или 10⁻⁵ М DETA в присутствии pFHHSiD (10⁻⁷ М, селективного антагониста рецептора M3). Обработка HUVEC. pFHHSiD полностью блокировал пролиферативные свойства DETA при всех концентрациях (таблица 1).
В этих условиях мы также исследовали, будет ли DEET увеличивать длину капилляров в клетках HUVEC. Аналогично, pFHHSiD значительно предотвратил увеличение длины капилляров, вызванное DEET (рис. 1a, b, серые столбцы). Кроме того, аналогичные эксперименты были проведены с siRNA M3. Хотя контрольная siRNA не была эффективна в стимулировании образования капилляров, подавление мускаринового рецептора M3 устранило способность DEET увеличивать длину капилляров (рис. 1a, b, черные столбцы).
Более того, как васкуляризация in vitro, так и неоваскуляризация in vivo, вызванные DEET в концентрациях 10⁻⁸ М или 10⁻⁵ М, были полностью заблокированы pFHHSiD (рис. 1c, d, кружки). Эти результаты указывают на то, что DEET способствует ангиогенезу через путь, чувствительный к селективным антагонистам рецептора M3 или siRNA M3.
Ацетилхолинэстераза (АХЭ) является молекулярной мишенью ДЭЭТ. Такие препараты, как донепезил, которые действуют как ингибиторы АХЭ, могут стимулировать ангиогенез эндотелиальных клеток in vitro и в моделях ишемии задних конечностей мышей14. Мы исследовали влияние двух концентраций ДЭЭТ на активность фермента АХЭ в клетках пупочной вены человека (HUVEC). Низкие (10⁻⁸ М) и высокие (10⁻⁵ М) концентрации ДЭЭТ снижали активность эндотелиальной АХЭ по сравнению с контрольными условиями (рис. 2).
Обе концентрации ДЭЭТ (10⁻⁸ М и 10⁻⁵ М) снижали активность ацетилхолинэстеразы в клетках HUVEC. В качестве контроля ингибиторов ацетилхолинэстеразы использовали BW284c51 (10⁻⁵ М). Результаты выражены в процентах активности АХЭ в клетках HUVEC, обработанных двумя концентрациями ДЭЭТ, по сравнению с клетками, обработанными контрольным раствором. Значения представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM) шести независимых экспериментов. *p < 0,05 по сравнению с контролем (критерий Краскала-Уоллиса и множественный сравнительный тест Данна).
Оксид азота (NO) участвует в ангиогенном процессе 33, поэтому было изучено производство NO в клетках HUVEC, стимулированных DEET. Производство NO в эндотелиальных клетках, обработанных DEET, увеличилось по сравнению с контрольными клетками, но достигло статистической значимости только при дозе 10⁻⁸ М (рис. 3c). Для определения молекулярных изменений, контролирующих производство NO, индуцированное DEET, экспрессию и активацию eNOS анализировали методом вестерн-блоттинга. Хотя обработка DEET не изменяла экспрессию eNOS, она значительно увеличивала фосфорилирование eNOS в его активирующем сайте (Ser-1177), одновременно уменьшая его ингибиторный сайт (Thr-495) по сравнению с необработанными клетками по фосфорилированию eNOS (рис. 3d). Кроме того, было рассчитано отношение фосфорилированного eNOS в активирующем и ингибиторном сайтах после нормализации количества фосфорилированного eNOS к общему количеству фермента. Это соотношение значительно увеличилось в клетках HUVEC, обработанных каждой концентрацией DEET, по сравнению с необработанными клетками (рис. 3d).
Наконец, экспрессия VEGF, одного из основных проангиогенных факторов, была проанализирована методом вестерн-блоттинга. DEET значительно увеличил экспрессию VEGF, тогда как pFHHSiD полностью блокировал эту экспрессию.
Поскольку действие ДЭЭТ чувствительно как к фармакологической блокаде, так и к снижению активности рецепторов М3, мы проверили гипотезу о том, что ДЭЭТ может усиливать кальциевую сигнализацию. Удивительно, но ДЭЭТ не смог увеличить цитоплазматический кальций в клетках HUVEC (данные не показаны) и HEK/M3 (рис. 4a, b) при обеих использованных концентрациях.
Дата публикации: 30 декабря 2024 г.