Противогельминтный препарат N,N-диэтил-м-толуамид (ДЭТА) ингибирует АХЭ (ацетилхолинэстеразу) и обладает потенциальными канцерогенными свойствами из-за чрезмерной васкуляризации. В данной работе мы показываем, что ДЭТА специфически стимулирует эндотелиальные клетки, способствующие ангиогенезу, тем самым усиливая рост опухоли. ДЭТА активирует клеточные процессы, ведущие к ангиогенезу, включая пролиферацию, миграцию и адгезию. Это связано с повышенной продукцией NO и экспрессией VEGF в эндотелиальных клетках. Подавление М3 или использование фармакологических ингибиторов М3 устраняло все эти эффекты, что свидетельствует о том, что индуцированный ДЭТА ангиогенез является чувствительным к М3. Эксперименты, включающие кальциевую сигнализацию в эндотелиальных и HEK-клетках, сверхэкспрессирующих М3-рецепторы, а также исследования связывания и стыковки, указывают на то, что ДЭТА действует как аллостерический модулятор М3-рецепторов. Более того, ДЭТА ингибирует АХЭ, тем самым увеличивая биодоступность ацетилхолина и его связывание с М3-рецепторами, а также усиливая проангиогенные эффекты посредством аллостерической регуляции.
Первичные эндотелиальные клетки (ЭК) были выделены из аорты швейцарских мышей. Метод выделения был адаптирован из протокола Кобаяши [26]. Энтотелиальные клетки мышей культивировали в среде EBM-2 с добавлением 5% инактивированной нагреванием сыворотки крупного рогатого скота (ССК) до четвёртого пассажа.
Влияние двух концентраций ДЭТА на пролиферацию клеток HUVEC, U87MG или BF16F10 анализировали с помощью набора для анализа пролиферации клеток CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Вкратце, 5·103 клеток на лунку высевали в 96-луночный планшет, оставляли для прикрепления на ночь, а затем обрабатывали ДЭТА в течение 24 часов. После удаления питательной среды добавляли раствор, связывающий краситель, в каждую лунку микропланшета и инкубировали клетки при 37 °C в течение 30 минут. Уровни флуоресценции определяли с помощью многорежимного микропланшетного ридера Mithras LB940 (Berthold Technologies, Бад-Вильдбад, Германия), оснащенного фильтрами возбуждения 485 нм и фильтрами испускания 530 нм.
Клетки HUVEC высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 104 клеток на лунку. Клетки обрабатывали ДЭТА в течение 24 часов. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью колориметрического МТТ-теста (Sigma-Aldrich, M5655). Значения оптической плотности получали на многорежимном микропланшетном ридере (Mithras LB940) при длине волны 570 нм.
Эффекты ДЭТА изучались с помощью тестов на ангиогенез in vitro. Обработка ДЭТА в концентрации 10-8 М или 10-5 М приводила к увеличению длины капилляров в клетках HUVEC (рис. 1a, b, белые столбцы). По сравнению с контрольной группой, обработка ДЭТА в концентрации от 10-14 до 10-5 М показала, что длина капилляров достигала плато при концентрации 10-8 М (Дополнительный рис. S2). Существенных различий в проангиогенном эффекте клеток HUVEC, обработанных ДЭТА в концентрации 10-8 М и 10-5 М, in vitro не обнаружено.
Чтобы определить влияние ДЭТА на неоваскуляризацию, мы провели исследования неоваскуляризации in vivo. Через 14 дней у мышей, которым вводили эндотелиальные клетки, предварительно культивированные с ДЭТА в концентрации 10-8 М или 10-5 М, наблюдалось значительное повышение содержания гемоглобина (рис. 1c, белые столбцы).
Кроме того, была изучена неоваскуляризация, вызванная DEET, у мышей с ксенотрансплантатом U87MG, которым ежедневно (внутрибрюшинно) вводили DEET в дозе, которая, как известно, индуцирует концентрацию в плазме 10-5 M, что является нормальным для людей, подвергшихся воздействию. у 23. Выявляемые опухоли (т. е. опухоли >100 мм3) наблюдались через 14 дней после инъекции клеток U87MG мышам. На 28-й день рост опухолей был значительно усилен у мышей, получавших DEET, по сравнению с контрольными мышами (рис. 1d, квадраты). Кроме того, окрашивание опухолей CD31 показало, что DEET значительно увеличивает площадь капилляров, но не плотность микрососудов. (рис. 1e–g).
Для определения роли мускариновых рецепторов в пролиферации, индуцированной ДЭТА, использовали ДЭТА в концентрации 10-8 М или 10-5 М в присутствии pFHHSiD (10-7 М, селективный антагонист М3-рецепторов). Обработка клеток HUVEC. pFHHSiD полностью блокировал пролиферативные свойства ДЭТА во всех концентрациях (таблица 1).
В этих условиях мы также исследовали, увеличит ли ДЭТА длину капилляров в клетках HUVEC. Аналогичным образом, pFHHSiD значительно предотвратил индуцированное ДЭТА увеличение длины капилляров (рис. 1a, b, серые столбцы). Кроме того, аналогичные эксперименты были проведены с siRNA M3. Хотя контрольная siRNA не способствовала образованию капилляров, подавление мускаринового рецептора M3 лишило ДЭТА способности увеличивать длину капилляров (рис. 1a, b, черные столбцы).
Более того, как васкуляризация, вызванная ДЭТА в концентрациях 10-8 М или 10-5 М in vitro, так и неоваскуляризация in vivo были полностью блокированы pFHHSiD (рис. 1c, d, кружки). Эти результаты свидетельствуют о том, что ДЭТА стимулирует ангиогенез через путь, чувствительный к селективным антагонистам М3-рецепторов или к siRNA М3.
Молекулярной мишенью ДЭТА является АХЭ. Такие препараты, как донепезил, действующие как ингибиторы АХЭ, могут стимулировать ангиогенез эндотелиальных клеток in vitro и в моделях ишемии задних конечностей у мышей14. Мы исследовали влияние двух концентраций ДЭТА на активность фермента АХЭ в клетках HUVEC. Низкие (10⁻¹⁴ М) и высокие (10⁻¹ ...
Обе концентрации ДЭТА (10-8 М и 10-5 М) снижали активность ацетилхолинэстеразы в клетках HUVEC. BW284c51 (10-5 М) использовали в качестве контроля для ингибиторов ацетилхолинэстеразы. Результаты выражены в процентах от активности АХЭ в клетках HUVEC, обработанных двумя концентрациями ДЭТА, по сравнению с клетками, обработанными плацебо. Значения представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM) шести независимых экспериментов. *p < 0,05 по сравнению с контролем (критерий множественных сравнений Краскела-Уоллиса и Данна).
Оксид азота (NO) участвует в ангиогенном процессе 33, поэтому было изучено производство NO в стимулированных DEET клетках HUVEC. Производство NO эндотелием, обработанным DEET, увеличилось по сравнению с контрольными клетками, но достигло значимости только при дозе 10-8 M (рис. 3c). Для определения молекулярных изменений, контролирующих производство NO, индуцированное DEET, экспрессию и активацию eNOS анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Хотя обработка DEET не изменила экспрессию eNOS, она значительно увеличила фосфорилирование eNOS в его активирующем центре (Ser-1177) и одновременно уменьшила его ингибирующий центр (Thr-495) по сравнению с необработанными клетками в фосфорилировании eNOS (рис. 3d). Кроме того, соотношение фосфорилированного eNOS в центре активации и ингибирующем центре было рассчитано после нормализации количества фосфорилированного eNOS к общему количеству фермента. Это соотношение значительно увеличилось в HUVEC, обработанных каждой концентрацией DEET, по сравнению с необработанными клетками (рис. 3d).
Наконец, экспрессия VEGF, одного из основных проангиогенных факторов, была проанализирована с помощью вестерн-блоттинга. ДЭТА значительно увеличил экспрессию VEGF, тогда как pFHHSiD полностью блокировал эту экспрессию.
Поскольку эффекты ДЭТА чувствительны как к фармакологической блокаде, так и к подавлению активности М3-рецепторов, мы проверили гипотезу о том, что ДЭТА может усиливать кальциевую сигнализацию. Удивительно, но ДЭТА не увеличивал концентрацию кальция в цитоплазме клеток HUVEC (данные не представлены) и HEK/M3 (рис. 4а, б) в обеих использованных концентрациях.
Время публикации: 30 декабря 2024 г.