Противогельминтный препарат N,N-диэтил-м-толуамид (ДЭТА) было сообщено, что ингибирует AChE (ацетилхолинэстеразу) и имеет потенциальные канцерогенные свойства из-за чрезмерной васкуляризации. В этой статье мы показываем, что DEET специфически стимулирует эндотелиальные клетки, которые способствуют ангиогенезу, тем самым увеличивая рост опухоли. DEET активирует клеточные процессы, ведущие к ангиогенезу, включая пролиферацию, миграцию и адгезию. Это связано с повышенной выработкой NO и экспрессией VEGF в эндотелиальных клетках. Подавление M3 или использование фармакологических ингибиторов M3 отменило все эти эффекты, предполагая, что DEET-индуцированный ангиогенез является M3-чувствительным. Эксперименты, включающие сигнализацию кальция в эндотелиальных и HEK-клетках, сверхэкспрессирующих рецепторы M3, а также исследования связывания и стыковки, указывают на то, что DEET действует как аллостерический модулятор рецепторов M3. Кроме того, DEET ингибирует AChE, тем самым увеличивая биодоступность ацетилхолина и его связывание с рецепторами M3, а также усиливая проангиогенные эффекты посредством аллостерической регуляции.
Первичные EC были выделены из аорты швейцарских мышей. Метод экстракции был адаптирован из протокола Кобаяши 26 . Мышиные EC культивировались в среде EBM-2 с добавлением 5% инактивированной нагреванием FBS до четвертого пассажа.
Влияние двух концентраций DEET на пролиферацию HUVEC, U87MG или BF16F10 анализировали с помощью набора для анализа пролиферации клеток CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Вкратце, 5.103 клеток на лунку высевали в 96-луночный планшет, оставляли для прикрепления на ночь, а затем обрабатывали DEET в течение 24 ч. После удаления питательной среды добавляли связывающий краситель раствор в каждую лунку микропланшета и инкубировали клетки при 37 °C в течение 30 мин. Уровни флуоресценции определяли с помощью многорежимного микропланшетного ридера Mithras LB940 (Berthold Technologies, Бад-Вильдбад, Германия), оснащенного фильтрами возбуждения 485 нм и фильтрами испускания 530 нм.
HUVEC высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 104 клеток на лунку. Клетки обрабатывали DEET в течение 24 ч. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью колориметрического анализа MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Значения оптической плотности получали на многорежимном микропланшетном ридере (Mithras LB940) при длине волны 570 нм.
Эффекты DEET изучались с помощью анализов ангиогенеза in vitro. Обработка 10-8 M или 10-5 M DEET увеличила образование длины капилляров в HUVEC (рис. 1a, b, белые столбцы). По сравнению с контрольной группой обработка концентрациями DEET от 10-14 до 10-5 M показала, что длина капилляров достигла плато при 10-8 M DEET (дополнительный рис. S2). Не было обнаружено существенной разницы в проангиогенном эффекте in vitro HUVEC, обработанных DEET в диапазоне концентраций 10-8 M и 10-5 M.
Чтобы определить влияние ДЭТА на неоваскуляризацию, мы провели исследования неоваскуляризации in vivo. Через 14 дней мыши, которым вводили эндотелиальные клетки, предварительно культивированные с 10-8 М или 10-5 М ДЭТА, показали значительное увеличение содержания гемоглобина (рис. 1c, белые столбцы).
Кроме того, неоваскуляризация, вызванная DEET, была изучена у мышей с ксенотрансплантатом U87MG, которым ежедневно (ip) вводили DEET в дозе, которая, как известно, индуцирует концентрацию в плазме 10-5 M, что является нормой у людей, подвергшихся воздействию. у 23. Обнаруживаемые опухоли (т. е. опухоли >100 мм3) наблюдались через 14 дней после инъекции клеток U87MG мышам. На 28-й день рост опухолей был значительно усилен у мышей, получавших DEET, по сравнению с контрольными мышами (рис. 1d, квадраты). Кроме того, окрашивание опухолей CD31 показало, что DEET значительно увеличил площадь капилляров, но не плотность микрососудов. (рис. 1e–g).
Для определения роли мускариновых рецепторов в пролиферации, вызванной DETA, использовали 10-8 M или 10-5 M DETA в присутствии pFHHSiD (10-7 M, селективный антагонист рецептора M3). Обработка HUVEC. pFHHSiD полностью блокировал пролиферативные свойства DETA во всех концентрациях (таблица 1).
В этих условиях мы также исследовали, увеличит ли DEET длину капилляров в клетках HUVEC. Аналогичным образом, pFHHSiD значительно предотвратил индуцированную DEET длину капилляров (рис. 1a, b, серые столбцы). Кроме того, аналогичные эксперименты были проведены с M3 siRNA. Хотя контрольная siRNA не была эффективна в содействии образованию капилляров, подавление мускаринового рецептора M3 отменило способность DEET увеличивать длину капилляров (рис. 1a, b, черные столбцы).
Более того, как 10-8 M или 10-5 M DEET-индуцированная васкуляризация in vitro, так и неоваскуляризация in vivo были полностью заблокированы pFHHSiD (рис. 1c, d, круги). Эти результаты указывают на то, что DEET способствует ангиогенезу через путь, чувствительный к селективным антагонистам рецептора M3 или M3 siRNA.
AChE является молекулярной мишенью DEET. Такие препараты, как донепезил, которые действуют как ингибиторы AChE, могут стимулировать ангиогенез EC in vitro и в моделях ишемии задних конечностей у мышей14. Мы протестировали влияние двух концентраций DEET на активность фермента AChE в HUVEC. Низкие (10-8 M) и высокие (10-5 M) концентрации DEET снижали активность эндотелиальной AChE по сравнению с контрольными условиями (рис. 2).
Обе концентрации DEET (10-8 M и 10-5 M) снижали активность ацетилхолинэстеразы на HUVEC. BW284c51 (10-5 M) использовали в качестве контроля для ингибиторов ацетилхолинэстеразы. Результаты выражены в процентах от активности AChE на HUVEC, обработанных двумя концентрациями DEET, по сравнению с клетками, обработанными носителем. Значения выражены как среднее значение ± SEM шести независимых экспериментов. *p < 0,05 по сравнению с контролем (критерий множественного сравнения Крускала-Уоллиса и Данна).
Оксид азота (NO) участвует в ангиогенном процессе 33, поэтому было изучено производство NO в стимулированных DEET HUVECs. Производство NO эндотелием, обработанным DEET, было увеличено по сравнению с контрольными клетками, но достигло значимости только при дозе 10-8 M (рис. 3c). Чтобы определить молекулярные изменения, контролирующие производство NO, вызванное DEET, экспрессию и активацию eNOS анализировали с помощью вестерн-блоттинга. Хотя обработка DEET не изменила экспрессию eNOS, она значительно увеличила фосфорилирование eNOS в его активирующем сайте (Ser-1177) при одновременном снижении его ингибирующего сайта (Thr-495) по сравнению с необработанными клетками в фосфорилировании eNOS (рис. 3d). Кроме того, соотношение фосфорилированного eNOS в активирующем сайте и ингибирующем сайте было рассчитано после нормализации количества фосфорилированного eNOS к общему количеству фермента. Это соотношение было значительно увеличено в HUVEC, обработанных каждой концентрацией ДЭТА, по сравнению с необработанными клетками (рис. 3d).
Наконец, экспрессия VEGF, одного из основных проангиогенных факторов, была проанализирована с помощью вестерн-блоттинга. DEET значительно увеличил экспрессию VEGF, тогда как pFHHSiD полностью блокировал эту экспрессию.
Поскольку эффекты DEET чувствительны как к фармакологической блокаде, так и к подавлению рецепторов M3, мы проверили гипотезу о том, что DEET может усиливать сигнализацию кальция. Удивительно, но DEET не смог увеличить цитоплазматический кальций в HUVEC (данные не показаны) и HEK/M3 (рис. 4a, b) для обеих использованных концентраций.
Время публикации: 30 декабря 2024 г.