В данном исследовании изучалось стимулирующее воздействие комбинированного лечениярегуляторы роста растенийБыло проведено исследование влияния 2,4-D и кинетина, а также наночастиц оксида железа (Fe₃O₄-NPs) на морфогенез in vitro и производство вторичных метаболитов у *Hypericum perforatum* L. Оптимизированная обработка [2,4-D (0,5 мг/л) + кинетин (2 мг/л) + Fe₃O₄-NPs (4 мг/л)] значительно улучшила параметры роста растений: высота растений увеличилась на 59,6%, длина корней — на 114,0%, количество почек — на 180,0%, а свежая масса каллуса — на 198,3% по сравнению с контрольной группой. Эта комбинированная обработка также повысила эффективность регенерации (50,85%) и увеличила содержание гиперицина на 66,6%. Анализ методом ГХ-МС выявил высокое содержание гиперозида, β-патолена и цетилового спирта, составляющее 93,36% от общей площади пика, в то время как содержание общих фенолов и флавоноидов увеличилось на целых 80,1%. Эти результаты указывают на то, что регуляторы роста растений (РРР) и наночастицы Fe₃O₄ (Fe₃O₄-НП) оказывают синергетический эффект, стимулируя органогенез и накопление биоактивных соединений, что представляет собой многообещающую стратегию для биотехнологического улучшения лекарственных растений.
Зверобой продырявленный (Hypericum perforatum L.), также известный как зверобой, — многолетнее травянистое растение семейства Hypericaceae, имеющее экономическую ценность.[1] К его потенциальным биологически активным компонентам относятся природные дубильные вещества, ксантоны, флороглюцинол, нафталендиантрон (гиперин и псевдогиперин), флавоноиды, фенольные кислоты и эфирные масла.[2,3,4] Зверобой можно размножать традиционными методами; однако сезонность традиционных методов, низкая всхожесть семян и восприимчивость к болезням ограничивают его потенциал для крупномасштабного выращивания и непрерывного образования вторичных метаболитов.[1,5,6]
Таким образом, культивирование тканей in vitro считается эффективным методом для быстрого размножения растений, сохранения ресурсов зародышевой плазмы и увеличения выхода лекарственных соединений [7, 8]. Регуляторы роста растений (РРР) играют решающую роль в регулировании морфогенеза и необходимы для культивирования каллуса и целых организмов in vitro. Оптимизация их концентраций и комбинаций имеет решающее значение для успешного завершения этих процессов развития [9]. Поэтому понимание соответствующего состава и концентрации регуляторов важно для улучшения роста и регенеративной способности зверобоя (H. perforatum) [10].
Наночастицы оксида железа (Fe₃O₄) — это класс наночастиц, которые были или разрабатываются для культивирования тканей. Fe₃O₄ обладает значительными магнитными свойствами, хорошей биосовместимостью и способностью стимулировать рост растений и снижать стресс окружающей среды, поэтому он привлек значительное внимание в разработке методов культивирования тканей. Потенциальные области применения этих наночастиц могут включать оптимизацию культивирования in vitro для стимуляции деления клеток, улучшения усвоения питательных веществ и активации антиоксидантных ферментов [11].
Несмотря на то, что наночастицы продемонстрировали хорошее стимулирующее воздействие на рост растений, исследований по комбинированному применению наночастиц Fe₃O₄ и оптимизированных регуляторов роста растений в *H. perforatum* по-прежнему мало. Чтобы восполнить этот пробел в знаниях, в данном исследовании оценивалось влияние их комбинированного воздействия на морфогенез in vitro и производство вторичных метаболитов, что позволит получить новые данные для улучшения характеристик лекарственных растений. Таким образом, данное исследование преследует две цели: (1) оптимизировать концентрацию регуляторов роста растений для эффективного стимулирования образования каллуса, регенерации побегов и укоренения in vitro; и (2) оценить влияние наночастиц Fe₃O₄ на параметры роста in vitro. В планах на будущее – оценка выживаемости регенерированных растений в процессе акклиматизации (in vitro). Ожидается, что результаты данного исследования значительно повысят эффективность микроразмножения *H. perforatum*, тем самым способствуя устойчивому использованию и биотехнологическому применению этого важного лекарственного растения.
В данном исследовании мы получили листовые экспланты от однолетних растений зверобоя, выращенных в полевых условиях (материнские растения). Эти экспланты использовались для оптимизации условий культивирования in vitro. Перед культивированием листья тщательно промывали под проточной дистиллированной водой в течение нескольких минут. Затем поверхность эксплантов дезинфицировали, погружая в 70% этанол на 30 секунд, после чего погружали в 1,5% раствор гипохлорита натрия (NaOCl), содержащий несколько капель Tween 20, на 10 минут. Наконец, экспланты трижды промывали стерильной дистиллированной водой перед переносом на следующую культуральную среду.
В течение следующих четырех недель измерялись параметры регенерации побегов, включая скорость регенерации, количество побегов на эксплант и длину побегов. Когда регенерированные побеги достигали длины не менее 2 см, их переносили на среду для укоренения, состоящую из среды MS половинной концентрации, 0,5 мг/л индолемасляной кислоты (ИБК) и 0,3% гуаровой камеди. Культивирование для укоренения продолжалось в течение трех недель, в течение которых измерялись скорость укоренения, количество корней и длина корней. Каждая обработка повторялась три раза, при этом в каждой повторной группе культивировалось по 10 эксплантов, что давало приблизительно 30 эксплантов на каждую обработку.
Высота растений измерялась в сантиметрах (см) с помощью линейки, от основания растения до кончика самого высокого листа. Длина корней измерялась в миллиметрах (мм) сразу после аккуратного извлечения рассады и удаления субстрата. Количество почек на экспланте подсчитывалось непосредственно на каждом растении. Количество черных пятен на листьях, известных как узелки, измерялось визуально. Считается, что эти черные узелки представляют собой железы, содержащие гиперицин, или окислительные пятна, и используются в качестве физиологического индикатора реакции растения на обработку. После удаления всего субстрата свежая масса рассады измерялась с помощью электронных весов с точностью до миллиграммов (мг).
Метод расчета скорости образования каллуса следующий: после культивирования эксплантов в среде, содержащей различные регуляторы роста (киназы, 2,4-D и Fe3O4), в течение четырех недель подсчитывается количество эксплантов, способных к образованию каллуса. Формула для расчета скорости образования каллуса следующая:
Каждый вариант обработки повторяли трижды, при этом в каждом повторении исследовали не менее 10 эксплантов.
Показатель регенерации отражает долю каллусной ткани, успешно завершившей процесс дифференциации почек после стадии образования каллуса. Этот показатель демонстрирует способность каллусной ткани трансформироваться в дифференцированную ткань и расти в новые органы растения.
Коэффициент укоренения — это отношение числа ветвей, способных к укоренению, к общему числу ветвей. Этот показатель отражает успешность стадии укоренения, которая имеет решающее значение в микроразмножении и размножении растений, поскольку хорошее укоренение способствует лучшей выживаемости сеянцев в условиях выращивания.
Соединения гиперицина экстрагировали 90% метанолом. Пятьдесят мг высушенного растительного материала добавляли к 1 мл метанола и подвергали ультразвуковой обработке в течение 20 мин при 30 кГц в ультразвуковом очистителе (модель A5120-3YJ) при комнатной температуре в темноте. После ультразвуковой обработки образец центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость собирали, и абсорбцию гиперицина измеряли при 592 нм с помощью спектрофотометра Plus-3000 S согласно методу, описанному Conceiçao et al. [14].
Большинство обработок регуляторами роста растений (РРР) и наночастицами оксида железа (Fe₃O₄-НП) не вызывали образования черных клубеньков на регенерированных листьях побегов. Клубеньки не наблюдались ни в одной из обработок с 0,5 или 1 мг/л 2,4-D, 0,5 или 1 мг/л кинетина, а также 1, 2 или 4 мг/л наночастиц оксида железа. В нескольких комбинациях наблюдалось небольшое увеличение развития клубеньков (но статистически незначимое) при более высоких концентрациях кинетина и/или наночастиц оксида железа, например, комбинация 2,4-D (0,5–2 мг/л) с кинетином (1–1,5 мг/л) и наночастицами оксида железа (2–4 мг/л). Эти результаты показаны на рисунке 2. Черные клубеньки представляют собой железы, богатые гиперицином, как естественного происхождения, так и полезные. В этом исследовании черные узелки были в основном связаны с побурением тканей, что указывает на благоприятную среду для накопления гиперицина. Обработка 2,4-D, кинетином и наночастицами Fe₃O₄ способствовала росту каллуса, уменьшала побурение и увеличивала содержание хлорофилла, что свидетельствует об улучшении метаболической функции и потенциальном снижении окислительного повреждения [37]. В этом исследовании оценивалось влияние кинетина в сочетании с 2,4-D и наночастицами Fe₃O₄ на рост и развитие каллуса зверобоя (рис. 3a–g). Предыдущие исследования показали, что наночастицы Fe₃O₄ обладают противогрибковой и антимикробной активностью [38, 39] и, при использовании в сочетании с регуляторами роста растений, могут стимулировать защитные механизмы растений и снижать показатели клеточного стресса [18]. Хотя биосинтез вторичных метаболитов регулируется генетически, их фактическая урожайность в значительной степени зависит от условий окружающей среды. Метаболические и морфологические изменения могут влиять на уровни вторичных метаболитов, регулируя экспрессию специфических генов растений и реагируя на факторы окружающей среды. Кроме того, индукторы могут запускать активацию новых генов, которые, в свою очередь, стимулируют ферментативную активность, в конечном итоге активируя множество биосинтетических путей и приводя к образованию вторичных метаболитов. Более того, другое исследование показало, что уменьшение затенения увеличивает воздействие солнечного света, тем самым повышая дневную температуру в естественной среде обитания *Hypericum perforatum*, что также способствует увеличению выхода гиперицина. На основе этих данных в данном исследовании изучалась роль наночастиц железа в качестве потенциальных индукторов в культуре тканей. Результаты показали, что эти наночастицы могут активировать гены, участвующие в биосинтезе гесперидина, посредством ферментативной стимуляции, что приводит к увеличению накопления этого соединения (рис. 2). Таким образом, по сравнению с растениями, растущими в естественных условиях, можно утверждать, что производство таких соединений in vivo также может быть усилено при сочетании умеренного стресса с активацией генов, участвующих в биосинтезе вторичных метаболитов. Комбинированные методы лечения, как правило, оказывают положительное влияние на скорость регенерации, но в некоторых случаях этот эффект ослабевает. В частности, обработка 1 мг/л 2,4-D, 1,5 мг/л киназы и различными концентрациями могла независимо и значительно увеличить скорость регенерации на 50,85% по сравнению с контрольной группой (рис. 4c). Эти результаты свидетельствуют о том, что определенные комбинации наногормонов могут действовать синергически, способствуя росту растений и производству метаболитов, что имеет большое значение для тканевой культуры лекарственных растений. Палмер и Келлер [50] показали, что обработка 2,4-D может независимо индуцировать образование каллуса у St. perforatum, в то время как добавление киназы значительно усиливает образование каллуса и регенерацию. Этот эффект был обусловлен улучшением гормонального баланса и стимуляцией деления клеток. Бал и др. [51] обнаружили, что обработка Fe₃O₄-NP может независимо усиливать функцию антиоксидантных ферментов, тем самым способствуя росту корней у St. perforatum. Культуральные среды, содержащие наночастицы Fe₃O₄ в концентрациях 0,5 мг/л, 1 мг/л и 1,5 мг/л, улучшили скорость регенерации растений льна [52]. Использование кинетина, 2,4-дихлорбензотиазолинона и наночастиц Fe₃O₄ значительно улучшило скорость образования каллуса и корней, однако необходимо учитывать потенциальные побочные эффекты использования этих гормонов для регенерации in vitro. Например, длительное или высококонцентрированное использование 2,4-дихлорбензотиазолинона или кинетина может привести к соматической клональной изменчивости, окислительному стрессу, аномальной морфологии каллуса или витрификации. Следовательно, высокая скорость регенерации не обязательно предсказывает генетическую стабильность. Все регенерированные растения следует оценивать с использованием молекулярных маркеров (например, RAPD, ISSR, AFLP) или цитогенетического анализа для определения их однородности и сходства с растениями in vivo [53,54,55].
В данном исследовании впервые продемонстрировано, что комбинированное использование регуляторов роста растений (2,4-D и кинетина) с наночастицами Fe₃O₄ может усиливать морфогенез и накопление ключевых биоактивных метаболитов (включая гиперицин и гиперозид) в *Hypericum perforatum*. Оптимизированный режим обработки (1 мг/л 2,4-D + 1 мг/л кинетина + 4 мг/л Fe₃O₄-NPs) не только максимизировал образование каллуса, органогенез и выход вторичных метаболитов, но и продемонстрировал мягкий индуцирующий эффект, потенциально улучшая устойчивость растения к стрессу и его лекарственную ценность. Сочетание нанотехнологий и культуры растительных тканей обеспечивает устойчивую и эффективную платформу для крупномасштабного производства лекарственных соединений in vitro. Эти результаты открывают путь для промышленного применения и будущих исследований молекулярных механизмов, оптимизации дозировки и генетической точности, тем самым связывая фундаментальные исследования лекарственных растений с практической биотехнологией.
Дата публикации: 12 декабря 2025 г.