Рост апикальной меристемы побега (SAM) критически важен для структуры стебля. Фитогормоныгиббереллины(ГА) играют ключевую роль в координации роста растений, но их роль в АМП остается плохо изученной. В данной работе мы разработали ратиометрический биосенсор сигнализации ГА, сконструировав белок DELLA для подавления его важной регуляторной функции в транскрипционном ответе ГА, сохраняя при этом его деградацию при распознавании ГА. Мы демонстрируем, что этот биосенсор, основанный на деградации, точно регистрирует изменения уровней ГА и клеточного восприятия в процессе развития. Мы использовали этот биосенсор для картирования активности сигнализации ГА в АМП. Мы показываем, что высокие сигналы ГА присутствуют преимущественно в клетках, расположенных между зачатками органов, которые являются предшественниками клеток междоузлий. Используя подходы приобретения и потери функции, мы далее демонстрируем, что ГА регулирует ориентацию плоскости деления клеток, устанавливая каноническую клеточную организацию междоузлий, тем самым способствуя спецификации междоузлий в АМП.
Апикальная меристема побега (АПМ), расположенная в апексе побега, содержит нишу стволовых клеток, активность которых формирует боковые органы и стеблевые узлы модульным и итеративным образом на протяжении всей жизни растения. Каждая из этих повторяющихся единиц, или растительных узлов, включает междоузлия и боковые органы в узлах, а также пазушные меристемы в пазухах листьев1. Рост и организация растительных узлов изменяются в процессе развития. У Arabidopsis рост междоузлий подавляется во время вегетативной стадии, и пазушные меристемы остаются в состоянии покоя в пазухах розеточных листьев. При переходе к фазе цветения АПМ становится меристемой соцветия, формируя удлинённые междоузлия и пазушные почки, веточки в пазухах стеблевых листьев, а позднее и безлистные цветки2. Несмотря на значительный прогресс в понимании механизмов, контролирующих заложение листьев, цветков и ветвей, о том, как возникают междоузлия, известно относительно мало.
Понимание пространственно-временного распределения ГА поможет лучше понять функции этих гормонов в различных тканях и на разных стадиях развития. Визуализация деградации слияния RGA-GFP, экспрессируемого под действием его собственного промотора, дает важную информацию о регуляции общего уровня ГА в корнях15,16. Однако экспрессия RGA варьируется в разных тканях17 и регулируется ГА18. Таким образом, дифференциальная экспрессия промотора RGA может приводить к картине флуоресценции, наблюдаемой с RGA-GFP, и, таким образом, этот метод не является количественным. Совсем недавно биоактивная ГА, меченная флуоресцеином (Fl),19,20 выявила накопление ГА в эндокортексе корня и регуляцию ее клеточных уровней посредством транспорта ГА. Недавно сенсор FRET ГА nlsGPS1 показал, что уровни ГА коррелируют с удлинением клеток в корнях, тычиночных нитях и выращенных в темноте гипокотилях21. Однако, как мы видели, концентрация ГА — не единственный параметр, контролирующий активность сигнализации ГА, поскольку она зависит от сложных сенсорных процессов. В данной работе, основываясь на нашем понимании сигнальных путей DELLA и ГА, мы сообщаем о разработке и характеристике ратиометрического биосенсора, основанного на деградации, для сигнализации ГА. Для разработки этого количественного биосенсора мы использовали мутантный ГА-чувствительный РГА, который был слит с флуоресцентным белком и повсеместно экспрессировался в тканях, а также ГА-нечувствительный флуоресцентный белок. Мы показываем, что слияния мутантных белков РГА не мешают эндогенной сигнализации ГА при повсеместной экспрессии, и что этот биосенсор может количественно оценивать сигнальную активность, возникающую как в результате поступления ГА, так и обработки сигнала ГА сенсорным аппаратом с высоким пространственно-временным разрешением. Мы использовали этот биосенсор для картирования пространственно-временного распределения активности сигнализации ГА и количественной оценки того, как ГА регулирует поведение клеток в эпидермисе SAM. Мы демонстрируем, что ГА регулирует ориентацию плоскости деления клеток САМ, расположенных между зачатками органов, тем самым определяя каноническую клеточную организацию междоузлия.
Наконец, мы задались вопросом, может ли qmRGA сообщать об изменениях эндогенных уровней ГА, используя растущие гипокотили. Ранее мы показали, что нитрат стимулирует рост, увеличивая синтез ГА и, в свою очередь, деградацию DELLA34. Соответственно, мы наблюдали, что длина гипокотиля у проростков pUBQ10::qmRGA, выращенных в условиях обильного поступления нитрата (10 мМ NO−), была значительно больше, чем у проростков, выращенных в условиях дефицита нитрата (Дополнительный рис. 6a). В соответствии с ответом роста, сигналы ГА были выше в гипокотилях проростков, выращенных в условиях 10 мМ NO−, чем у проростков, выращенных в отсутствие нитрата (Дополнительный рис. 6b, c). Таким образом, qmRGA также позволяет отслеживать изменения в сигнальной системе ГА, вызванные эндогенными изменениями концентрации ГА.
Чтобы понять, зависит ли сигнальная активность ГА, детектируемая qmRGA, от концентрации ГА и его восприятия, как и ожидалось, исходя из конструкции сенсора, мы проанализировали экспрессию трёх рецепторов GID1 в вегетативных и репродуктивных тканях. У проростков репортерная линия GID1-GUS показала высокую экспрессию GID1a и c в семядолях (рис. 3a–c). Кроме того, все три рецептора экспрессировались в листьях, примордиях боковых корней, кончиках корней (за исключением корневого чехлика GID1b) и сосудистой системе (рис. 3a–c). В АМП соцветия мы обнаружили сигналы GUS только для GID1b и 1c (дополнительные рис. 7a–c). Гибридизация in situ подтвердила эти паттерны экспрессии и дополнительно продемонстрировала, что GID1c равномерно экспрессировался на низком уровне в АМП, тогда как GID1b демонстрировал более высокую экспрессию на периферии АМП (дополнительные рис. 7d–l). Трансляционное слияние pGID1b::2xmTQ2-GID1b также выявило градуированный диапазон экспрессии GID1b: от низкой или нулевой экспрессии в центре SAM до высокой экспрессии на границах органов (Дополнительный рис. 7m). Таким образом, рецепторы GID1 распределены неравномерно по тканям и внутри них. В последующих экспериментах мы также наблюдали, что сверхэкспрессия GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) увеличивала чувствительность qmRGA в гипокотилях к внешнему воздействию ГА (рис. 3d, e). Напротив, флуоресценция, измеренная qd17mRGA в гипокотиле, была нечувствительна к обработке ГА3 (рис. 3f, g). В обоих анализах проростки обрабатывали высокими концентрациями ГА (100 мкМ ГА3) для оценки быстрого поведения сенсора, при котором способность связываться с рецептором GID1 усиливалась или терялась. В совокупности эти результаты подтверждают, что биосенсор qmRGA выполняет комбинированную функцию сенсора GA и GA, и предполагают, что дифференциальная экспрессия рецептора GID1 может существенно модулировать излучательную способность сенсора.
На сегодняшний день распределение сигналов ГА в АМП остаётся неясным. Поэтому мы использовали растения, экспрессирующие qmRGA, и репортер стволовых клеток pCLV3::mCherry-NLS35 для построения количественных карт активности сигнальной активности ГА высокого разрешения, фокусируясь на слое L1 (эпидермис; рис. 4a, b, см. «Методы и дополнительные методы»), поскольку L1 играет ключевую роль в регуляции роста АМП36. В данном случае экспрессия pCLV3::mCherry-NLS обеспечила фиксированную геометрическую точку отсчёта для анализа пространственно-временного распределения активности сигнальной активности ГА37. Хотя ГА считается необходимым для развития латеральных органов4, мы наблюдали, что сигналы ГА были низкими в флоральном примордии (P), начиная со стадии P3 (рис. 4a, b), тогда как молодые примордии P1 и P2 имели умеренную активность, аналогичную таковой в центральной области (рис. 4a, b). Более высокая активность ГА-сигнализации была обнаружена на границах зачатков органов, начиная с P1/P2 (по бокам границы) и достигая пика на P4, а также во всех клетках периферической области, расположенной между зачатками (рис. 4a, b и дополнительный рис. 8a, b). Эта более высокая активность ГА-сигнализации наблюдалась не только в эпидермисе, но и в слоях L2 и верхних слоях L3 (дополнительный рис. 8b). Паттерн ГА-сигнализации, выявленный в АМП с помощью qmRGA, также оставался неизменным с течением времени (дополнительные рис. 8c–f, k). Хотя экспрессия конструкции qd17mRGA систематически снижалась в АМП растений T3 из пяти независимых линий, которые мы подробно охарактеризовали, нам удалось проанализировать паттерны флуоресценции, полученные с помощью конструкции pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (дополнительные рис. 8g–j, l). В этой контрольной линии были обнаружены только незначительные изменения в соотношении флуоресценции в SAM, но в центре SAM мы наблюдали четкое и неожиданное снижение VENUS, связанное с TagBFP. Это подтверждает, что паттерн сигнализации, наблюдаемый qmRGA, отражает GA-зависимую деградацию mRGA-VENUS, но также демонстрирует, что qmRGA может переоценивать активность сигнализации GA в центре меристемы. Подводя итог, наши результаты выявляют паттерн сигнализации GA, который в первую очередь отражает распределение примордиев. Такое распределение межпримордиальной области (IPR) обусловлено постепенным установлением высокой активности сигнализации GA между развивающимся примордием и центральной областью, в то время как в то же время активность сигнализации GA в примордии снижается (рис. 4c, d).
Распределение рецепторов GID1b и GID1c (см. выше) предполагает, что дифференциальная экспрессия рецепторов ГА помогает формировать паттерн сигнальной активности ГА в АМП. Мы задались вопросом, может ли быть задействовано дифференциальное накопление ГА. Для исследования этой возможности мы использовали сенсор FRET ГА nlsGPS121. Повышенная частота активации была обнаружена в АМП nlsGPS1, обработанной 10 мкМ GA4+7 в течение 100 мин (Дополнительный рисунок 9a–e), что указывает на то, что nlsGPS1 реагирует на изменения концентрации ГА в АМП, как и в корнях21. Пространственное распределение частоты активации nlsGPS1 выявило относительно низкие уровни ГА во внешних слоях АМП, но показало, что они были повышены в центре и на границах АМП (рис. 4e и Дополнительные рисунки 9a,c). Это предполагает, что GA также распределена в SAM с пространственным паттерном, сопоставимым с выявленным с помощью qmRGA. В качестве дополнительного подхода мы также обработали SAM флуоресцентным GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) или только Fl в качестве отрицательного контроля. Сигнал Fl был распределен по всей SAM, включая центральную область и примордиум, хотя и с меньшей интенсивностью (рис. 4j и дополнительный рис. 10d). Напротив, все три GA-Fl накапливались специфически в границах примордия и в разной степени в остальной части IPR, при этом GA7-Fl накапливался в самом большом домене IPR (рис. 4k и дополнительный рис. 10a,b). Количественная оценка интенсивности флуоресценции показала, что соотношение интенсивности IPR к интенсивности без IPR было выше в SAM, обработанном GA-Fl, по сравнению с SAM, обработанным Fl (рис. 4l и дополнительный рис. 10c). В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что GA присутствует в более высоких концентрациях в клетках IPR, расположенных ближе всего к границе органа. Это позволяет предположить, что паттерн сигнальной активности GA в SAM обусловлен как дифференциальной экспрессией рецепторов GA, так и дифференциальным накоплением GA в клетках IPR вблизи границ органа. Таким образом, наш анализ выявил неожиданный пространственно-временной паттерн сигнальной активности GA с более низкой активностью в центре и зачатке SAM и более высокой активностью в IPR в периферической области.
Чтобы понять роль дифференциальной активности ГА-сигнализации в АМП, мы проанализировали корреляцию между активностью ГА-сигнализации, клеточным ростом и делением клеток, используя покадровую съемку АМП в режиме реального времени с помощью qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Учитывая роль ГА в регуляции роста, ожидалась положительная корреляция с параметрами клеточного роста. Поэтому мы сначала сравнили карты активности ГА-сигнализации с картами скорости роста клеточной поверхности (как прокси-параметра силы клеточного роста для данной клетки и для дочерних клеток при делении) и с картами анизотропии роста, которая измеряет направленность клеточного роста (также используется здесь для данной клетки и для дочерних клеток при делении; рис. 5a, b, см. «Методы и дополнительные методы»). Наши карты скорости роста клеточной поверхности АМП согласуются с предыдущими наблюдениями38,39, с минимальными скоростями роста на границе и максимальными скоростями роста в развивающихся цветках (рис. 5a). Анализ главных компонент (PCA) показал, что активность сигнализации GA отрицательно коррелировала с интенсивностью роста клеточной поверхности (Рисунок 5c). Мы также показали, что главные оси вариации, включая вход сигнализации GA и интенсивность роста, были ортогональны направлению, определяемому высокой экспрессией CLV3, что подтверждает исключение клеток из центра SAM в остальных анализах. Корреляционный анализ Спирмена подтвердил результаты PCA (Рисунок 5d), указав, что более высокие сигналы GA в IPR не приводят к более высокому росту клеток. Однако корреляционный анализ выявил небольшую положительную корреляцию между активностью сигнализации GA и анизотропией роста (Рисунок 5c, d), что позволяет предположить, что более высокая сигнализация GA в IPR влияет на направление роста клеток и, возможно, на положение плоскости деления клетки.
a, b Тепловые карты среднего поверхностного роста (a) и анизотропии роста (b) в SAM, усредненные по семи независимым растениям (используемым в качестве прокси для силы и направления расширения клеток соответственно). c Анализ PCA включал следующие переменные: сигнал GA, интенсивность поверхностного роста, анизотропия поверхностного роста и экспрессия CLV3. Компонент PCA 1 в основном отрицательно коррелировал с интенсивностью поверхностного роста и положительно коррелировал с сигналом GA. Компонент PCA 2 в основном положительно коррелировал с анизотропией поверхностного роста и отрицательно коррелировал с экспрессией CLV3. Проценты представляют вариацию, объясняемую каждым компонентом. d Анализ корреляции Спирмена между сигналом GA, интенсивностью поверхностного роста и анизотропией поверхностного роста в масштабе ткани, исключая CZ. Число справа представляет собой значение rho Спирмена между двумя переменными. Звездочки обозначают случаи, когда корреляция/отрицательная корреляция высокозначимы. e 3D визуализация клеток L1 Col-0 SAM с помощью конфокальной микроскопии. Новые клеточные стенки, образовавшиеся в SAM (но не в примордии) через 10 ч, окрашены в соответствии со значениями их углов. Цветовая полоса показана в правом нижнем углу. На врезке показано соответствующее трехмерное изображение в 0 ч. Эксперимент был повторен дважды с аналогичными результатами. f Диаграммы ящиков отображают скорость деления клеток в IPR и не-IPR Col-0 SAM (n = 10 независимых растений). Центральная линия показывает медиану, а границы ящиков указывают на 25-й и 75-й процентили. Усы указывают на минимальное и максимальное значения, определенные с помощью программного обеспечения R. Значения P были получены с помощью двустороннего t-критерия Уэлча. g, h Схематическая диаграмма, показывающая (g) как измерить угол новой клеточной стенки (пурпурный) по отношению к радиальному направлению от центра SAM (белая пунктирная линия) (рассматриваются только значения острого угла, т. е. 0–90°), и (h) окружное/латеральное и радиальное направления внутри меристемы. i Гистограммы частоты ориентации плоскости деления клеток поперек SAM (темно-синий), IPR (средний синий) и не-IPR (светло-синий) соответственно. Значения P были получены с помощью двустороннего теста Колмогорова-Смирнова. Эксперимент был повторен дважды с аналогичными результатами. j Гистограммы частоты ориентации плоскости деления клеток IPR вокруг P3 (светло-зеленый), P4 (средний зеленый) и P5 (темно-зеленый) соответственно. Значения P были получены с помощью двустороннего теста Колмогорова-Смирнова. Эксперимент был повторен дважды с аналогичными результатами.
Поэтому далее мы исследовали корреляцию между сигнализацией GA и активностью клеточного деления, выявляя новообразованные клеточные стенки в ходе анализа (рис. 5e). Этот подход позволил нам измерить частоту и направление клеточного деления. К нашему удивлению, мы обнаружили, что частота делений клеток в IPR и остальной части SAM (не IPR, рис. 5f) была схожей, что указывает на то, что различия в сигнализации GA между клетками IPR и не IPR не оказывают существенного влияния на клеточное деление. Это, а также положительная корреляция между сигнализацией GA и анизотропией роста, побудили нас рассмотреть вопрос о том, может ли активность сигнализации GA влиять на ориентацию плоскости клеточного деления. Мы измерили ориентацию новой клеточной стенки под острым углом к радиальной оси, соединяющей центр меристемы и центр новой клеточной стенки (рис. 5e-i), и наблюдали чёткую тенденцию к делению клеток под углами, близкими к 90°, относительно радиальной оси, с самыми высокими частотами, наблюдавшимися при 70–80° (23,28%) и 80–90° (22,62%) (рис. 5e,i), что соответствует делениям клеток в окружном/поперечном направлении (рис. 5h). Чтобы изучить вклад ГА-сигнализации в это поведение клеточного деления, мы проанализировали параметры клеточного деления в IPR и не-IPR отдельно (рис. 5i). Мы наблюдали, что распределение углов деления в клетках IPR отличалось от такового в клетках без IPR или в клетках во всей АМП, при этом клетки IPR демонстрировали более высокую долю латеральных/циркулярных делений, т.е. 70–80° и 80–90° (33,86% и 30,71% соответственно, соответствующие доли) (рис. 5i). Таким образом, наши наблюдения выявили связь между высокой активностью GA-сигнализации и ориентацией плоскости деления клетки, близкой к окружному направлению, аналогично корреляции между активностью GA-сигнализации и анизотропией роста (рис. 5c, d). Для дальнейшего подтверждения пространственной сохранности этой связи мы измерили ориентацию плоскости деления в клетках IPR, окружающих примордиум, начиная с P3, поскольку наибольшая активность GA-сигнализации была обнаружена в этой области, начиная с P4 (рис. 4). Углы деления IPR в области P3 и P4 статистически значимых различий не выявили, хотя в IPR в области P4 наблюдалась повышенная частота латеральных делений клеток (рис. 5j). Однако в клетках IPR в области P5 различия в ориентации плоскости деления клеток стали статистически значимыми, с резким увеличением частоты поперечных делений клеток (рис. 5j). В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что сигнализация GA может контролировать ориентацию клеточных делений в SAM, что согласуется с предыдущими сообщениями40,41 о том, что высокая активность сигнала GA может индуцировать латеральную ориентацию клеточных делений в IPR.
Предполагается, что клетки в IPR будут включены не в примордии, а в междоузлия2,42,43. Поперечная ориентация клеточных делений в IPR может привести к типичной организации параллельных продольных рядов эпидермальных клеток в междоузлиях. Наши наблюдения, описанные выше, позволяют предположить, что сигнальные пути ГА, вероятно, играют роль в этом процессе, регулируя направление клеточного деления.
Потеря функции нескольких генов DELLA приводит к конститутивному ответу GA, и мутанты della могут быть использованы для проверки этой гипотезы44. Сначала мы проанализировали паттерны экспрессии пяти генов DELLA в АМП. Транскрипционное слияние линии GUS45 показало, что GAI, RGA, RGL1 и RGL2 (в значительно меньшей степени) экспрессируются в АМП (дополнительные рисунки 11a–d). Гибридизация in situ дополнительно продемонстрировала, что мРНК GAI накапливается специфически в примордиях и развивающихся цветках (дополнительный рисунок 11e). мРНК RGL1 и RGL3 были обнаружены по всему пологу АМП и в более старых цветках, тогда как мРНК RGL2 была более многочисленна в пограничной области (дополнительные рисунки 11f–h). Конфокальная визуализация pRGL3::RGL3-GFP SAM подтвердила экспрессию, наблюдаемую in situ гибридизацией, и показала, что белок RGL3 накапливается в центральной части SAM (Дополнительный рис. 11i). Используя линию pRGA::GFP-RGA, мы также обнаружили, что белок RGA накапливается в SAM, но его количество снижается на границе, начиная с P4 (Дополнительный рис. 11j). Примечательно, что паттерны экспрессии RGL3 и RGA согласуются с более высокой активностью GA-сигнализации в IPR, обнаруженной с помощью qmRGA (рис. 4). Более того, эти данные указывают на то, что все DELLA экспрессируются в SAM, и что их экспрессия в совокупности охватывает всю SAM.
Затем мы проанализировали параметры клеточного деления в АМП дикого типа (Ler, контроль) и пятикратных (глобальных) мутантах gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della (рис. 6а, б). Интересно, что мы наблюдали статистически значимое смещение распределения частот углов деления клеток в АМП глобального мутанта della по сравнению с диким типом (рис. 6в). Это изменение в АМП глобального мутанта della было обусловлено увеличением частоты углов 80–90° (34,71% против 24,55%) и, в меньшей степени, углов 70–80° (23,78% против 20,18%), т.е. соответствующих поперечным клеточным делениям (рис. 6в). Частота непоперечных делений (0–60°) также была ниже у мутанта della global (рис. 6c). Частота поперечных делений клеток была значительно увеличена в АМП мутанта della global (рис. 6b). Частота поперечных делений клеток в ИПР также была выше у мутанта della global по сравнению с диким типом (рис. 6d). За пределами области ИПР дикий тип имел более равномерное распределение углов деления клеток, тогда как мутант della global предпочитал тангенциальные деления, такие как ИПР (рис. 6e). Мы также количественно оценили ориентацию клеточных делений в АМП пятикратных мутантов ga2-оксидазы (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 и ga2ox6-2), мутантного фона, неактивного по ГА, в котором ГА накапливается. В соответствии с повышением уровня ГА, САМ пятикратного мутанта ga2ox соцветия была больше, чем у Col-0 (Дополнительные рис. 12a, b), и, по сравнению с Col-0, пятикратный САМ ga2ox демонстрировал заметно иное распределение углов деления клеток, при этом частота углов увеличивалась с 50° до 90°, т.е. снова в пользу тангенциальных делений (Дополнительные рис. 12a–c). Таким образом, мы показываем, что конститутивная активация ГА-сигнализации и накопление ГА индуцируют латеральные деления клеток в области интракраниального протока (ИПР) и остальной части САМ.
a, b 3D визуализация слоя L1 PI-окрашенного Ler (a) и глобального мутанта della (b) SAM с помощью конфокальной микроскопии. Показаны новые клеточные стенки, образовавшиеся в SAM (но не в примордии) в течение 10-часового периода, окрашенные в соответствии с их угловыми значениями. На врезке показана SAM в момент времени 0 часов. Цветовая полоса отображается в правом нижнем углу. Стрелка на (b) указывает на пример выровненных клеточных файлов в глобальном мутанте della. Эксперимент был повторен дважды с аналогичными результатами. ce сравнение распределения частот ориентаций плоскостей деления клеток во всем SAM (d), IPR (e) и не-IPR (f) между Ler и глобальным мутантом della. Значения P были получены с помощью двустороннего теста Колмогорова-Смирнова. f, g 3D визуализация конфокальных изображений окрашенной PI АМП трансгенных растений Col-0 (i) и pCUC2::gai-1-VENUS (j). Панели (a, b) показывают новые клеточные стенки (но не примордии), сформированные в АМП в течение 10 ч. Эксперимент был повторен дважды с аналогичными результатами. h–j Сравнение распределения частот ориентаций плоскостей деления клеток, расположенных во всей АМП (h), ИПР (i) и не-ИПР (j), между растениями Col-0 и pCUC2::gai-1-VENUS. Значения P были получены с помощью двустороннего критерия Колмогорова–Смирнова.
Затем мы протестировали эффект ингибирования GA-сигнализации, специфичный для IPR. Для этого мы использовали промотор семядольного купола 2 (CUC2) для управления экспрессией доминантно-негативного белка gai-1, слитого с геном VENUS (в линии pCUC2::gai-1-VENUS). В АМП дикого типа промотор CUC2 управляет экспрессией большинства IPR в АМП, включая пограничные клетки, начиная с 4-го дня развития, и аналогичная специфическая экспрессия наблюдалась у растений pCUC2::gai-1-VENUS (см. ниже). Распределение углов деления клеток в АМП или IPR у растений pCUC2::gai-1-VENUS существенно не отличалось от такового у дикого типа, хотя неожиданно мы обнаружили, что клетки без IPR у этих растений делились с более высокой частотой – 80–90° (рис. 6f–j).
Было высказано предположение, что направление деления клеток зависит от геометрии АМП, в частности от растягивающего напряжения, создаваемого изгибом ткани46. Поэтому мы задались вопросом, изменилась ли форма АМП у мутанта della global и растений pCUC2::gai-1-VENUS. Как сообщалось ранее12, размер АМП у мутанта della global был больше, чем у дикого типа (Дополнительные рис. 13a, b, d). Гибридизация in situ РНК CLV3 и STM подтвердила расширение меристемы у мутантов della и дополнительно показала латеральное расширение ниши стволовых клеток (Дополнительные рис. 13e, f, h, i). Однако кривизна АМП была схожей у обоих генотипов (Дополнительные рис. 13k, m, n, p). Мы наблюдали аналогичное увеличение размера у мутанта gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della с квадрупольным мутантом без изменения кривизны по сравнению с диким типом (Дополнительные рисунки 13c, d, g, j, l, o, p). Частота ориентации клеточных делений также была затронута у мутанта della с квадрупольным мутантом, но в меньшей степени, чем у мутанта della с монолитным мутантом (Дополнительные рисунки 12d–f). Этот эффект дозировки, наряду с отсутствием влияния на кривизну, предполагает, что остаточная активность RGL3 у мутанта Della с квадрупольным мутантом ограничивает изменения ориентации клеточных делений, вызванные потерей активности DELLA, и что изменения в латеральных клеточных делениях происходят в ответ на изменения активности сигнальной системы GA, а не на изменения геометрии SAM. Как описано выше, промотор CUC2 управляет экспрессией IPR в SAM, начиная с P4 (Дополнительные рис. 14a, b), и, напротив, pCUC2::gai-1-VENUS SAM имеет уменьшенный размер, но более высокую кривизну (Дополнительные рис. 14c–h). Это изменение морфологии pCUC2::gai-1-VENUS SAM может приводить к иному распределению механических напряжений по сравнению с диким типом, у которого высокие окружные напряжения возникают на меньшем расстоянии от центра SAM47. В качестве альтернативы, изменения морфологии pCUC2::gai-1-VENUS SAM могут быть вызваны изменениями региональных механических свойств, вызванными экспрессией трансгена48. В обоих случаях это может частично компенсировать эффекты изменений в сигнальном пути GA, увеличивая вероятность деления клеток в окружной/поперечной ориентации, что объясняет наши наблюдения.
В совокупности наши данные подтверждают, что более высокая активность ГА-сигнализации играет активную роль в латеральной ориентации плоскости деления клеток в ИПР. Они также показывают, что кривизна меристемы также влияет на ориентацию плоскости деления клеток в ИПР.
Поперечная ориентация плоскости деления в IPR, обусловленная высокой активностью сигнальной системы GA, предполагает, что GA предварительно организует радиальный клеточный ряд в эпидермисе внутри SAM, определяя клеточную организацию, которая впоследствии будет обнаружена в эпидермальном междоузлии. Действительно, такие клеточные ряды часто наблюдались на SAM-изображениях мутантов della global (рис. 6b). Таким образом, для дальнейшего изучения онтогенетической функции пространственного паттерна сигнальной системы GA в SAM мы использовали покадровую съемку для анализа пространственной организации клеток в IPR у растений дикого типа (Ler и Col-0), мутантов della global и трансгенных растений pCUC2::gai-1-VENUS.
Мы обнаружили, что qmRGA показал, что активность сигнала GA в IPR увеличивалась от P1/P2 и достигала пика на P4, и эта картина оставалась постоянной с течением времени (рис. 4a–f и дополнительный рис. 8c–f, k). Для анализа пространственной организации клеток в IPR при увеличении сигнала GA мы пометили клетки Ler IPR выше и по бокам от P4 в соответствии с их судьбой развития, проанализированной через 34 часа после первого наблюдения, т. е. более чем через два пластидных времени, что позволило нам проследить клетки IPR в ходе развития примордия от P1/P2 до P4. Мы использовали три разных цвета: желтый для тех клеток, которые были интегрированы в примордии вблизи P4, зеленый для тех, которые находились в IPR, и фиолетовый для тех, которые участвовали в обоих процессах (рис. 7a–c). В момент t0 (0 ч) перед P4 были видны 1–2 слоя клеток IPR (рис. 7a). Как и ожидалось, деление этих клеток происходило преимущественно в поперечной плоскости деления (рис. 7a–c). Аналогичные результаты были получены с использованием Col-0 SAM (с акцентом на P3, край которого складывается аналогично P4 у Ler), хотя у этого генотипа складка, образованная на краю цветка, быстрее скрывала клетки IPR (рис. 7g–i). Таким образом, характер деления клеток IPR предорганизует их в радиальные ряды, как в междоузлиях. Организация радиальных рядов и локализация клеток IPR между последовательными органами позволяют предположить, что эти клетки являются предшественниками междоузлий.
В данной работе мы разработали ратиометрический биосенсор для передачи сигналов ГА, qmRGA, который позволяет количественно картировать сигнальную активность ГА, возникающую в результате комбинированных концентраций ГА и рецепторов ГА, минимизируя при этом интерференцию с эндогенными сигнальными путями, тем самым предоставляя информацию о функции ГА на клеточном уровне. С этой целью мы сконструировали модифицированный белок DELLA, mRGA, который утратил способность связываться с партнерами взаимодействия DELLA, но сохраняет чувствительность к протеолизу, индуцированному ГА. qmRGA реагирует как на экзогенные, так и на эндогенные изменения уровня ГА, а его динамические сенсорные свойства позволяют оценивать пространственно-временные изменения сигнальной активности ГА в процессе развития. qmRGA также является очень гибким инструментом, поскольку его можно адаптировать к различным тканям, изменяя промотор, используемый для его экспрессии (при необходимости), и, учитывая консервативность сигнального пути ГА и мотива PFYRE у покрытосеменных растений, его, вероятно, можно будет перенести на другие виды22. В соответствии с этим, эквивалентная мутация в белке DELLA риса SLR1 (HYY497AAA) также была показана для подавления активности репрессора роста SLR1, при этом лишь незначительно снижая его деградацию, опосредованную GA, аналогично mRGA23. Примечательно, что недавние исследования на Arabidopsis показали, что мутация одной аминокислоты в домене PFYRE (S474L) изменила транскрипционную активность RGA, не влияя на его способность взаимодействовать с партнерами по факторам транскрипции50. Хотя эта мутация очень близка к 3 аминокислотным заменам, присутствующим в mRGA, наши исследования показывают, что эти две мутации изменяют различные характеристики DELLA. Хотя большинство партнеров по факторам транскрипции связываются с доменами LHR1 и SAW DELLA26,51 некоторые консервативные аминокислоты в домене PFYRE могут способствовать стабилизации этих взаимодействий.
Развитие междоузлий является ключевым признаком в архитектуре растений и повышении урожайности. qmRGA выявил более высокую активность сигнализации GA в клетках-предшественниках междоузлий IPR. Объединив количественную визуализацию и генетику, мы показали, что паттерны сигнализации GA накладываются на круговые/поперечные плоскости деления клеток в эпидермисе SAM, формируя организацию деления клеток, необходимую для развития междоузлий. Несколько регуляторов ориентации плоскости деления клеток были идентифицированы в процессе развития52,53. Наша работа представляет собой наглядный пример того, как активность сигнализации GA регулирует этот клеточный параметр. DELLA может взаимодействовать с префолдинговыми белковыми комплексами41, поэтому сигнализация GA может регулировать ориентацию плоскости деления клеток, напрямую влияя на ориентацию кортикальных микротрубочек40,41,54,55. Мы неожиданно показали, что в SAM коррелятом более высокой активности сигнализации GA было не удлинение или деление клеток, а только анизотропия роста, что согласуется с прямым влиянием GA на направление деления клеток в IPR. Однако мы не можем исключить, что этот эффект может быть также косвенным, например, опосредованным размягчением клеточной стенки под действием ГА56. Изменения свойств клеточной стенки вызывают механическое напряжение57,58, которое также может влиять на ориентацию плоскости деления клетки, влияя на ориентацию кортикальных микротрубочек39,46,59. Совместное действие механического напряжения, вызванного ГА, и прямой регуляции ориентации микротрубочек ГА может быть связано с формированием специфического паттерна ориентации деления клеток в междоузлиях, определяющего междоузлия, и для проверки этой идеи необходимы дальнейшие исследования. Аналогичным образом, предыдущие исследования подчеркнули важность DELLA-взаимодействующих белков TCP14 и 15 в контроле образования междоузлий60,61, и эти факторы могут опосредовать действие ГА вместе с BREVIPEDICELLUS (BP) и PENNYWISE (PNY), которые регулируют развитие междоузлий и, как было показано, влияют на сигнализацию ГА2,62. Учитывая, что DELLA взаимодействуют с сигнальными путями брассиностероидов, этилена, жасмоновой кислоты и абсцизовой кислоты (АБК)63,64 и что эти гормоны могут влиять на ориентацию микротрубочек65, влияние ГА на ориентацию деления клеток может также опосредоваться другими гормонами.
Ранние цитологические исследования показали, что как внутренние, так и внешние области АМП арабидопсиса необходимы для развития междоузлий2,42. Тот факт, что ГА активно регулирует деление клеток во внутренних тканях12, подтверждает двойную функцию ГА в регуляции размера меристемы и междоузлий в АМП. Направление деления клеток также строго регулируется во внутренней ткани АМП, и эта регуляция необходима для роста стебля52. Будет интересно изучить, играет ли ГА также роль в ориентации плоскости деления клеток во внутренней организации АМП, синхронизируя тем самым спецификацию и развитие междоузлий в АМП.
Растения выращивали in vitro в почве или среде 1x Мурасиге-Скуга (MS) (Duchefa), дополненной 1% сахарозы и 1% агара (Sigma), в стандартных условиях (16-часовой свет, 22 °C), за исключением экспериментов по росту гипокотиля и корней, в которых сеянцы выращивали на вертикальных пластинах при постоянном освещении и температуре 22 °C. Для экспериментов с нитратами растения выращивали на модифицированной среде MS (среда для растений bioWORLD), дополненной соответствующим количеством нитрата (0 или 10 мМ KNO3), 0,5 мМ NH4-сукцината, 1% сахарозы и 1% А-агара (Sigma) в условиях длинного дня.
ДНК GID1a, вставленная в pDONR221, была рекомбинирована с pDONR P4-P1R-pUBQ10 и pDONR P2R-P3-mCherry в pB7m34GW для получения pUBQ10::GID1a-mCherry. ДНК IDD2, вставленная в pDONR221, была рекомбинирована в pB7RWG266 для получения p35S:IDD2-RFP. Для создания pGID1b::2xmTQ2-GID1b фрагмент длиной 3,9 кб выше кодирующей области GID1b и фрагмент длиной 4,7 кб, содержащий кДНК GID1b (1,3 кб) и терминатор (3,4 кб), сначала были амплифицированы с использованием праймеров из Дополнительной таблицы 3, а затем вставлены в pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) и pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) соответственно и, наконец, рекомбинированы с pDONR221 2xmTQ268 в целевой вектор pGreen 012567 с использованием клонирования Gateway. Для создания pCUC2::LSSmOrange промоторная последовательность CUC2 (3229 п.н. выше ATG), за которой следовала кодирующая последовательность большого mOrange со смещением Стокса (LSSmOrange)69 с сигналом ядерной локализации N7 и терминатором транскрипции NOS, была собрана в вектор pGreen, таргетирующий канамицин, с использованием системы рекомбинации Gateway 3-fragment (Invitrogen). Растительный бинарный вектор был введен в штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101 и введен в листья Nicotiana benthamiana методом инфильтрации Agrobacterium и в Arabidopsis thaliana Col-0 методом погружения цветков, соответственно. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry и pCLV3::mCherry-NLS qmRGA были выделены из потомков F3 и F1 соответствующих скрещиваний соответственно.
Гибридизацию РНК in situ проводили на кончиках побегов длиной около 1 см72, которые собирали и немедленно фиксировали в растворе FAA (3,7% формальдегида, 5% уксусной кислоты, 50% этанола), предварительно охлажденном до 4 °C. После двух вакуумных обработок по 15 минут фиксатор меняли, и образцы инкубировали в течение ночи. КДНК GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 и RGL3 и антисмысловые зонды к их 3'-нетранслируемым областям (НТО) синтезировали с использованием праймеров, представленных в дополнительной таблице 3, как описано Розье и соавт.73. Зонды, меченые дигоксигенином, были иммунодетектированы с использованием антител к дигоксигенину (3000-кратное разведение; Roche, номер по каталогу: 11 093 274 910), а срезы были окрашены раствором 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата (BCIP, 250-кратное разведение)/нитросинего тетразолия (NBT, 200-кратное разведение).
Время публикации: 10 февраля 2025 г.