Рост апикальной меристемы побега (SAM) имеет решающее значение для архитектуры стебля. Растительные гормоныгиббереллины(GA) играют ключевую роль в координации роста растений, но их роль в SAM остается плохо изученной. Здесь мы разработали ратиометрический биосенсор сигнализации GA, сконструировав белок DELLA для подавления его важной регуляторной функции в транскрипционном ответе GA, сохраняя его деградацию при распознавании GA. Мы демонстрируем, что этот биосенсор на основе деградации точно регистрирует изменения уровней GA и клеточного восприятия во время развития. Мы использовали этот биосенсор для картирования активности сигнализации GA в SAM. Мы показываем, что высокие сигналы GA присутствуют преимущественно в клетках, расположенных между зачатками органов, которые являются предшественниками клеток междоузлий. Используя подходы усиления и потери функции, мы далее демонстрируем, что GA регулирует ориентацию плоскости деления клеток, устанавливая каноническую клеточную организацию междоузлий, тем самым способствуя спецификации междоузлий в SAM.
Апикальная меристема побега (SAM), расположенная на верхушке побега, содержит нишу стволовых клеток, активность которых генерирует боковые органы и стеблевые узлы модульным и итеративным образом на протяжении всей жизни растения. Каждая из этих повторяющихся единиц, или растительных узлов, включает междоузлия и боковые органы в узлах, а также пазушные меристемы в пазухах листьев1. Рост и организация растительных узлов изменяются в процессе развития. У Arabidopsis рост междоузлий подавляется во время вегетативной стадии, а пазушные меристемы остаются спящими в пазухах розеточных листьев. Во время перехода к цветочной фазе SAM становится меристемой соцветия, генерируя удлиненные междоузлия и пазушные почки, веточки в пазухах стеблевых листьев, а позднее и безлистные цветки2. Хотя мы достигли значительного прогресса в понимании механизмов, которые контролируют зарождение листьев, цветов и ветвей, относительно мало известно о том, как возникают междоузлия.
Понимание пространственно-временного распределения ГА поможет лучше понять функции этих гормонов в различных тканях и на различных стадиях развития. Визуализация деградации слияния RGA-GFP, экспрессируемого под действием его собственного промотора, дает важную информацию о регуляции общих уровней ГА в корнях15,16. Однако экспрессия RGA варьируется в зависимости от тканей17 и регулируется ГА18. Таким образом, дифференциальная экспрессия промотора RGA может приводить к картине флуоресценции, наблюдаемой с RGA-GFP, и, таким образом, этот метод не является количественным. Совсем недавно биоактивный флуоресцеин (Fl)-меченый ГА19,20 выявил накопление ГА в эндокортексе корня и регуляцию его клеточных уровней транспортом ГА. Недавно датчик FRET ГА nlsGPS1 показал, что уровни ГА коррелируют с удлинением клеток в корнях, нитях и выращенных в темноте гипокотилях21. Однако, как мы увидели, концентрация GA — не единственный параметр, контролирующий активность сигнализации GA, поскольку она зависит от сложных процессов восприятия. Здесь, основываясь на нашем понимании сигнальных путей DELLA и GA, мы сообщаем о разработке и характеристике ратиометрического биосенсора на основе деградации для сигнализации GA. Для разработки этого количественного биосенсора мы использовали мутантный GA-чувствительный RGA, который был слит с флуоресцентным белком и повсеместно экспрессировался в тканях, а также GA-нечувствительный флуоресцентный белок. Мы показываем, что слияния мутантного белка RGA не мешают эндогенной сигнализации GA при повсеместной экспрессии, и что этот биосенсор может количественно определять активность сигнализации, возникающую как в результате ввода GA, так и обработки сигнала GA сенсорным аппаратом с высоким пространственно-временным разрешением. Мы использовали этот биосенсор для картирования пространственно-временного распределения активности сигнализации GA и количественной оценки того, как GA регулирует клеточное поведение в эпидермисе SAM. Мы демонстрируем, что ГА регулирует ориентацию плоскости деления клеток SAM, расположенных между зачатками органов, тем самым определяя каноническую клеточную организацию междоузлия.
Наконец, мы задались вопросом, может ли qmRGA сообщать об изменениях в эндогенных уровнях GA с использованием растущих гипокотилей. Ранее мы показали, что нитрат стимулирует рост, увеличивая синтез GA и, в свою очередь, деградацию DELLA34. Соответственно, мы наблюдали, что длина гипокотиля у сеянцев pUBQ10::qmRGA, выращенных в условиях обильного поступления нитрата (10 мМ NO3−), была значительно больше, чем у сеянцев, выращенных в условиях дефицита нитрата (Дополнительный рис. 6a). В соответствии с реакцией роста, сигналы GA были выше в гипокотилях сеянцев, выращенных в условиях 10 мМ NO3−, чем у сеянцев, выращенных в отсутствие нитрата (Дополнительный рис. 6b, c). Таким образом, qmRGA также позволяет отслеживать изменения в сигнализации GA, вызванные эндогенными изменениями концентрации GA.
Чтобы понять, зависит ли сигнальная активность GA, обнаруженная qmRGA, от концентрации GA и восприятия GA, как и ожидалось на основе конструкции сенсора, мы проанализировали экспрессию трех рецепторов GID1 в вегетативных и репродуктивных тканях. У проростков репортерная линия GID1-GUS показала, что GID1a и c были высоко экспрессированы в семядолях (рис. 3a–c). Кроме того, все три рецептора были экспрессированы в листьях, примордиях боковых корней, кончиках корней (за исключением корневого чехлика GID1b) и сосудистой системе (рис. 3a–c). В SAM соцветия мы обнаружили сигналы GUS только для GID1b и 1c (дополнительный рис. 7a–c). Гибридизация in situ подтвердила эти паттерны экспрессии и дополнительно продемонстрировала, что GID1c был равномерно экспрессирован на низких уровнях в SAM, тогда как GID1b показал более высокую экспрессию на периферии SAM (дополнительный рис. 7d–l). Трансляционное слияние pGID1b::2xmTQ2-GID1b также выявило градуированный диапазон экспрессии GID1b, от низкой или нулевой экспрессии в центре SAM до высокой экспрессии на границах органов (Дополнительный рис. 7m). Таким образом, рецепторы GID1 неравномерно распределены по тканям и внутри них. В последующих экспериментах мы также наблюдали, что сверхэкспрессия GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) увеличивала чувствительность qmRGA в гипокотилях к внешнему применению GA (рис. 3d, e). Напротив, флуоресценция, измеренная qd17mRGA в гипокотиле, была нечувствительна к обработке GA3 (рис. 3f, g). Для обоих анализов сеянцы обрабатывали высокими концентрациями GA (100 мкМ GA3) для оценки быстрого поведения сенсора, при котором способность связываться с рецептором GID1 усиливалась или терялась. В совокупности эти результаты подтверждают, что биосенсор qmRGA выполняет комбинированную функцию как сенсор GA и GA, и предполагают, что дифференциальная экспрессия рецептора GID1 может существенно модулировать излучательную способность сенсора.
На сегодняшний день распределение сигналов GA в SAM остается неясным. Поэтому мы использовали растения, экспрессирующие qmRGA, и репортер стволовых клеток pCLV3::mCherry-NLS35 для расчета количественных карт активности сигнализации GA с высоким разрешением, сосредоточившись на слое L1 (эпидермис; рис. 4a, b, см. Методы и дополнительные методы), поскольку L1 играет ключевую роль в контроле роста SAM36. Здесь экспрессия pCLV3::mCherry-NLS обеспечила фиксированную геометрическую точку отсчета для анализа пространственно-временного распределения активности сигнализации GA37. Хотя GA считается необходимым для развития боковых органов4, мы наблюдали, что сигналы GA были низкими в зачатке цветка (P), начиная со стадии P3 (рис. 4a, b), тогда как молодые зачатки P1 и P2 имели умеренную активность, аналогичную таковой в центральной области (рис. 4a, b). Более высокая активность сигнализации GA была обнаружена на границах зачатков органов, начиная с P1/P2 (по бокам границы) и достигая пика на P4, а также во всех клетках периферической области, расположенной между зачатками (рис. 4a, b и дополнительный рис. 8a, b). Эта более высокая активность сигнализации GA наблюдалась не только в эпидермисе, но и в слоях L2 и верхних слоях L3 (дополнительный рис. 8b). Паттерн сигналов GA, обнаруженный в SAM с использованием qmRGA, также оставался неизменным с течением времени (дополнительный рис. 8c–f, k). Хотя конструкция qd17mRGA систематически подавлялась в SAM растений T3 из пяти независимых линий, которые мы подробно охарактеризовали, мы смогли проанализировать паттерны флуоресценции, полученные с помощью конструкции pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (дополнительный рис. 8g–j, l). В этой контрольной линии были обнаружены только незначительные изменения в соотношении флуоресценции в SAM, но в центре SAM мы наблюдали четкое и неожиданное снижение VENUS, связанное с TagBFP. Это подтверждает, что сигнальная картина, наблюдаемая qmRGA, отражает GA-зависимую деградацию mRGA-VENUS, но также демонстрирует, что qmRGA может переоценивать сигнальную активность GA в центре меристемы. Подводя итог, наши результаты выявляют сигнальную картину GA, которая в первую очередь отражает распределение примордиев. Это распределение межпримордиальной области (IPR) обусловлено постепенным установлением высокой сигнальной активности GA между развивающимся примордием и центральной областью, в то время как в то же время сигнальная активность GA в примордии снижается (рис. 4c, d).
Распределение рецепторов GID1b и GID1c (см. выше) предполагает, что дифференциальная экспрессия рецепторов GA помогает формировать паттерн сигнальной активности GA в SAM. Мы задались вопросом, может ли быть задействовано дифференциальное накопление GA. Для исследования этой возможности мы использовали сенсор FRET nlsGPS1 GA21. Повышенная частота активации была обнаружена в SAM nlsGPS1, обработанного 10 мкМ GA4+7 в течение 100 мин (дополнительный рис. 9a–e), что указывает на то, что nlsGPS1 реагирует на изменения концентрации GA в SAM, как и в корнях21. Пространственное распределение частоты активации nlsGPS1 выявило относительно низкие уровни GA во внешних слоях SAM, но показало, что они были повышены в центре и на границах SAM (рис. 4e и дополнительный рис. 9a,c). Это говорит о том, что GA также распределен в SAM с пространственной картиной, сопоставимой с той, что выявлена с помощью qmRGA. В качестве дополнительного подхода мы также обработали SAM флуоресцентным GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) или только Fl в качестве отрицательного контроля. Сигнал Fl был распределен по всей SAM, включая центральную область и примордиум, хотя и с меньшей интенсивностью (рис. 4j и дополнительный рис. 10d). Напротив, все три GA-Fl накапливались конкретно в границах примордиума и в разной степени в остальной части IPR, при этом GA7-Fl накапливался в самом большом домене в IPR (рис. 4k и дополнительный рис. 10a,b). Количественная оценка интенсивности флуоресценции показала, что отношение интенсивности IPR к интенсивности без IPR было выше в обработанном GA-Fl SAM по сравнению с обработанным Fl SAM (рис. 4l и дополнительный рис. 10c). В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что GA присутствует в более высоких концентрациях в клетках IPR, которые расположены ближе всего к границе органа. Это говорит о том, что паттерн активности сигнализации SAM GA является результатом как дифференциальной экспрессии рецепторов GA, так и дифференциального накопления GA в клетках IPR вблизи границ органа. Таким образом, наш анализ выявил неожиданный пространственно-временной паттерн сигнализации GA с более низкой активностью в центре и зачатке SAM и более высокой активностью в IPR в периферической области.
Чтобы понять роль дифференциальной активности сигнализации GA в SAM, мы проанализировали корреляцию между активностью сигнализации GA, расширением клеток и делением клеток с помощью покадровой съемки в реальном времени SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Учитывая роль GA в регуляции роста, ожидалась положительная корреляция с параметрами расширения клеток. Поэтому мы сначала сравнили карты активности сигнализации GA с картами скорости роста поверхности клеток (как прокси для силы расширения клеток для данной клетки и для дочерних клеток при делении) и с картами анизотропии роста, которая измеряет направленность расширения клеток (также используется здесь для данной клетки и для дочерних клеток при делении; рис. 5a,b, см. Методы и дополнительные методы). Наши карты скорости роста поверхности клеток SAM согласуются с предыдущими наблюдениями38,39, с минимальными скоростями роста на границе и максимальными скоростями роста в развивающихся цветках (рис. 5a). Анализ главных компонент (PCA) показал, что активность сигнализации GA отрицательно коррелировала с интенсивностью роста поверхности клеток (рисунок 5c). Мы также показали, что основные оси вариации, включая вход сигнализации GA и интенсивность роста, были ортогональны направлению, определяемому высокой экспрессией CLV3, что подтверждает исключение клеток из центра SAM в остальных анализах. Корреляционный анализ Спирмена подтвердил результаты PCA (рисунок 5d), указав, что более высокие сигналы GA в IPR не приводят к более высокому расширению клеток. Однако корреляционный анализ выявил небольшую положительную корреляцию между активностью сигнализации GA и анизотропией роста (рисунок 5c, d), что позволяет предположить, что более высокая сигнализация GA в IPR влияет на направление роста клеток и, возможно, на положение плоскости деления клеток.
a, b Тепловые карты среднего поверхностного роста (a) и анизотропии роста (b) в SAM, усредненные по семи независимым растениям (используются в качестве прокси для силы и направления расширения клеток соответственно). c Анализ PCA включал следующие переменные: сигнал GA, интенсивность поверхностного роста, анизотропию поверхностного роста и экспрессию CLV3. Компонент PCA 1 в основном отрицательно коррелировал с интенсивностью поверхностного роста и положительно коррелировал с сигналом GA. Компонент PCA 2 в основном положительно коррелировал с анизотропией поверхностного роста и отрицательно коррелировал с экспрессией CLV3. Проценты представляют собой вариацию, объясняемую каждым компонентом. d Анализ корреляции Спирмена между сигналом GA, интенсивностью поверхностного роста и анизотропией поверхностного роста в масштабе ткани, за исключением CZ. Число справа представляет собой значение rho Спирмена между двумя переменными. Звездочки обозначают случаи, когда корреляция/отрицательная корреляция имеет высокую значимость. e 3D-визуализация клеток Col-0 SAM L1 с помощью конфокальной микроскопии. Новые клеточные стенки, образованные в SAM (но не в примордии) через 10 ч, окрашены в соответствии со значениями их углов. Цветовая полоса показана в правом нижнем углу. На вставке показано соответствующее трехмерное изображение в 0 ч. Эксперимент был повторен дважды с аналогичными результатами. f Диаграммы ящиков отображают скорость деления клеток в IPR и не-IPR Col-0 SAM (n = 10 независимых растений). Центральная линия показывает медиану, а границы ящиков указывают на 25-й и 75-й процентили. Усы указывают на минимальные и максимальные значения, определенные с помощью программного обеспечения R. Значения P были получены с помощью двухстороннего t-критерия Уэлча. g, h Схематическая диаграмма, показывающая (g) как измерить угол новой клеточной стенки (пурпурный) по отношению к радиальному направлению от центра SAM (белая пунктирная линия) (рассматриваются только значения острого угла, т. е. 0–90°), и (h) окружное/латеральное и радиальное направления внутри меристемы. i Гистограммы частоты ориентации плоскости деления клеток поперек SAM (темно-синий), IPR (средний синий) и не-IPR (светло-синий) соответственно. Значения P были получены с помощью двухстороннего теста Колмогорова-Смирнова. Эксперимент был повторен дважды с аналогичными результатами. j Гистограммы частоты ориентации плоскости деления клеток IPR вокруг P3 (светло-зеленый), P4 (средний зеленый) и P5 (темно-зеленый) соответственно. Значения P были получены с помощью двухстороннего теста Колмогорова-Смирнова. Эксперимент был повторен дважды с аналогичными результатами.
Поэтому далее мы исследовали корреляцию между сигнализацией GA и активностью деления клеток, идентифицируя новообразованные клеточные стенки во время анализа (рис. 5e). Этот подход позволил нам измерить частоту и направление деления клеток. Удивительно, но мы обнаружили, что частота делений клеток в IPR и остальной части SAM (не IPR, рис. 5f) была схожей, что указывает на то, что различия в сигнализации GA между клетками IPR и не IPR не оказывают существенного влияния на деление клеток. Это, а также положительная корреляция между сигнализацией GA и анизотропией роста побудили нас рассмотреть вопрос о том, может ли активность сигнализации GA влиять на ориентацию плоскости деления клеток. Мы измерили ориентацию новой клеточной стенки как острый угол относительно радиальной оси, соединяющей центр меристемы и центр новой клеточной стенки (рис. 5e-i), и наблюдали четкую тенденцию клеток делиться под углами, близкими к 90° относительно радиальной оси, с самыми высокими частотами, наблюдаемыми при 70–80° (23,28%) и 80–90° (22,62%) (рис. 5e,i), что соответствует делениям клеток в окружном/поперечном направлении (рис. 5h). Чтобы изучить вклад сигнализации GA в это поведение деления клеток, мы проанализировали параметры деления клеток в IPR и не-IPR отдельно (рис. 5i). Мы наблюдали, что распределение углов деления в клетках IPR отличалось от такового в клетках без IPR или в клетках во всем SAM, при этом клетки IPR демонстрировали более высокую долю латеральных/круговых делений клеток, т. е. 70–80° и 80–90° (33,86% и 30,71% соответственно, соответствующие пропорции) (рис. 5i). Таким образом, наши наблюдения выявили связь между высокой сигнализацией GA и ориентацией плоскости деления клеток, близкой к окружному направлению, аналогичную корреляции между активностью сигнализации GA и анизотропией роста (рис. 5c, d). Для дальнейшего установления пространственной консервативности этой ассоциации мы измерили ориентацию плоскости деления в клетках IPR, окружающих примордиум, начиная с P3, поскольку самая высокая активность сигнализации GA была обнаружена в этой области, начиная с P4 (рис. 4). Углы деления IPR около P3 и P4 не показали статистически значимых различий, хотя в IPR около P4 наблюдалась повышенная частота латеральных делений клеток (рис. 5j). Однако в клетках IPR около P5 разница в ориентации плоскости деления клеток стала статистически значимой, с резким увеличением частоты поперечных делений клеток (рис. 5j). В совокупности эти результаты предполагают, что сигнализация GA может контролировать ориентацию клеточных делений в SAM, что согласуется с предыдущими сообщениями40,41 о том, что высокая сигнализация GA может вызывать латеральную ориентацию клеточных делений в IPR.
Прогнозируется, что клетки в IPR не будут включены в зачатки, а скорее в междоузлия2,42,43. Поперечная ориентация клеточных делений в IPR может привести к типичной организации параллельных продольных рядов эпидермальных клеток в междоузлиях. Наши наблюдения, описанные выше, предполагают, что сигнализация GA, вероятно, играет роль в этом процессе, регулируя направление клеточного деления.
Потеря функции нескольких генов DELLA приводит к конститутивному ответу GA, и мутанты della могут быть использованы для проверки этой гипотезы44. Сначала мы проанализировали паттерны экспрессии пяти генов DELLA в SAM. Транскрипционное слияние линии GUS45 показало, что GAI, RGA, RGL1 и RGL2 (в гораздо меньшей степени) были экспрессированы в SAM (дополнительный рис. 11a–d). Гибридизация in situ далее продемонстрировала, что мРНК GAI накапливается, в частности, в примордиях и развивающихся цветках (дополнительный рис. 11e). мРНК RGL1 и RGL3 были обнаружены по всему пологу SAM и в более старых цветках, тогда как мРНК RGL2 была более обильной в пограничной области (дополнительный рис. 11f–h). Конфокальная визуализация pRGL3::RGL3-GFP SAM подтвердила экспрессию, наблюдаемую с помощью гибридизации in situ, и показала, что белок RGL3 накапливается в центральной части SAM (Дополнительный рис. 11i). Используя линию pRGA::GFP-RGA, мы также обнаружили, что белок RGA накапливается в SAM, но его обилие уменьшается на границе, начиная с P4 (Дополнительный рис. 11j). Примечательно, что паттерны экспрессии RGL3 и RGA согласуются с более высокой активностью сигнализации GA в IPR, как обнаружено с помощью qmRGA (рис. 4). Более того, эти данные указывают на то, что все DELLA экспрессируются в SAM и что их экспрессия в совокупности охватывает всю SAM.
Затем мы проанализировали параметры деления клеток в SAM дикого типа (Ler, контроль) и мутантах gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) (рис. 6a, b). Интересно, что мы наблюдали статистически значимое смещение в распределении частот углов деления клеток в SAM глобального мутанта della по сравнению с диким типом (рис. 6c). Это изменение в мутанте della global было обусловлено увеличением частоты углов 80–90° (34,71% против 24,55%) и, в меньшей степени, углов 70–80° (23,78% против 20,18%), т. е. соответствующих поперечным делениям клеток (рис. 6c). Частота непоперечных делений (0–60°) также была ниже у мутанта della global (рис. 6c). Частота поперечных делений клеток была значительно увеличена в SAM мутанта della global (рис. 6b). Частота поперечных делений клеток в IPR также была выше у мутанта della global по сравнению с диким типом (рис. 6d). За пределами области IPR дикий тип имел более равномерное распределение углов деления клеток, тогда как мутант della global предпочитал тангенциальные деления, такие как IPR (рис. 6e). Мы также количественно оценили ориентацию клеточных делений в SAM пятикратных мутантов ga2-оксидазы (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 и ga2ox6-2), GA-неактивного мутантного фона, в котором GA накапливается. В соответствии с увеличением уровней GA, SAM пятикратного мутантного соцветия ga2ox был больше, чем у Col-0 (Дополнительный рис. 12a, b), и по сравнению с Col-0, пятикратный ga2ox SAM показал отчетливо иное распределение углов деления клеток, с увеличением частоты углов с 50° до 90°, т.е. снова в пользу тангенциальных делений (Дополнительный рис. 12a–c). Таким образом, мы показываем, что конститутивная активация сигнализации GA и накопление GA вызывают латеральные деления клеток в IPR и остальной части SAM.
a, b 3D визуализация слоя L1 окрашенного PI Ler (a) и глобального мутанта della (b) SAM с использованием конфокальной микроскопии. Новые клеточные стенки, образованные в SAM (но не в зачатке) в течение 10-часового периода, показаны и окрашены в соответствии с их угловыми значениями. Вставка показывает SAM в 0 часов. Цветовая полоса отображается в правом нижнем углу. Стрелка на (b) указывает на пример выровненных клеточных файлов в глобальном мутанте della. Эксперимент был повторен дважды с аналогичными результатами. ce сравнение распределения частот ориентаций плоскости деления клеток во всем SAM (d), IPR (e) и не-IPR (f) между Ler и глобальным della. Значения P были получены с использованием двустороннего теста Колмогорова-Смирнова. f, g 3D визуализация конфокальных изображений окрашенной PI SAM трансгенных растений Col-0 (i) и pCUC2::gai-1-VENUS (j). Панели (a, b) показывают новые клеточные стенки (но не примордии), сформированные в SAM в течение 10 ч. Эксперимент был повторен дважды с аналогичными результатами. h–j Сравнение распределения частот ориентаций плоскостей деления клеток, расположенных во всей SAM (h), IPR (i) и не-IPR (j) между растениями Col-0 и pCUC2::gai-1-VENUS. Значения P были получены с использованием двухстороннего теста Колмогорова–Смирнова.
Затем мы протестировали эффект ингибирования сигнализации GA конкретно в IPR. Для этого мы использовали промотор чашечки семядоли 2 (CUC2) для управления экспрессией доминантного отрицательного белка gai-1, слитого с VENUS (в линии pCUC2::gai-1-VENUS). В SAM дикого типа промотор CUC2 управляет экспрессией большинства IPR в SAM, включая пограничные клетки, начиная с P4, и похожая специфическая экспрессия наблюдалась в растениях pCUC2::gai-1-VENUS (см. ниже). Распределение углов деления клеток по SAM или IPR растений pCUC2::gai-1-VENUS существенно не отличалось от такового у дикого типа, хотя неожиданно мы обнаружили, что клетки без IPR в этих растениях делились с более высокой частотой 80–90° (рис. 6f–j).
Было высказано предположение, что направление деления клеток зависит от геометрии SAM, в частности, от растягивающего напряжения, создаваемого кривизной ткани46. Поэтому мы задались вопросом, была ли изменена форма SAM в растениях della global mutant и pCUC2::gai-1-VENUS. Как сообщалось ранее12, размер SAM della global mutant был больше, чем у дикого типа (дополнительный рис. 13a, b, d). Гибридизация in situ РНК CLV3 и STM подтвердила расширение меристемы у мутантов della и дополнительно показала латеральное расширение ниши стволовых клеток (дополнительный рис. 13e, f, h, i). Однако кривизна SAM была одинаковой у обоих генотипов (дополнительный рис. 13k, m, n, p). Мы наблюдали похожее увеличение размера у мутанта gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple без изменения кривизны по сравнению с диким типом (Дополнительный рис. 13c, d, g, j, l, o, p). Частота ориентации деления клеток также была затронута у мутанта della quadruple, но в меньшей степени, чем у мутанта della monolithic (Дополнительный рис. 12d–f). Этот эффект дозировки, наряду с отсутствием эффекта на кривизну, предполагает, что остаточная активность RGL3 у мутанта Della quadruple ограничивает изменения ориентации деления клеток, вызванные потерей активности DELLA, и что изменения в латеральных делениях клеток происходят в ответ на изменения в активности сигнализации GA, а не на изменения в геометрии SAM. Как описано выше, промотор CUC2 управляет экспрессией IPR в SAM, начиная с P4 (Дополнительный рис. 14a, b), и, напротив, pCUC2::gai-1-VENUS SAM имел уменьшенный размер, но более высокую кривизну (Дополнительный рис. 14c–h). Это изменение в морфологии pCUC2::gai-1-VENUS SAM может привести к иному распределению механических напряжений по сравнению с диким типом, в котором высокие окружные напряжения начинаются на более коротком расстоянии от центра SAM47. Альтернативно, изменения в морфологии pCUC2::gai-1-VENUS SAM могут быть результатом изменений в региональных механических свойствах, вызванных экспрессией трансгена48. В обоих случаях это может частично компенсировать эффекты изменений в сигнализации GA за счет увеличения вероятности того, что клетки будут делиться в окружной/поперечной ориентации, что объясняет наши наблюдения.
В совокупности наши данные подтверждают, что более высокая сигнализация GA играет активную роль в латеральной ориентации плоскости деления клеток в IPR. Они также показывают, что кривизна меристемы также влияет на ориентацию плоскости деления клеток в IPR.
Поперечная ориентация плоскости деления в IPR, обусловленная высокой активностью сигнализации GA, предполагает, что GA предварительно организует радиальный клеточный файл в эпидермисе в пределах SAM, чтобы определить клеточную организацию, которая позже будет обнаружена в эпидермальном междоузлии. Действительно, такие клеточные файлы часто были видны на изображениях SAM мутантов della global (рис. 6b). Таким образом, для дальнейшего изучения функции развития пространственного паттерна сигнализации GA в SAM мы использовали покадровую съемку для анализа пространственной организации клеток в IPR у дикого типа (Ler и Col-0), мутантов della global и трансгенных растений pCUC2::gai-1-VENUS.
Мы обнаружили, что qmRGA показал, что активность сигнализации GA в IPR увеличивалась от P1/P2 и достигала пика на P4, и эта картина оставалась постоянной с течением времени (рис. 4a–f и дополнительный рис. 8c–f, k). Чтобы проанализировать пространственную организацию клеток в IPR с увеличением сигнала GA, мы пометили клетки Ler IPR выше и по бокам от P4 в соответствии с их судьбой развития, проанализированной через 34 часа после первого наблюдения, т. е. более чем через два пластидных времени, что позволило нам проследить клетки IPR во время развития примордия от P1/P2 до P4. Мы использовали три разных цвета: желтый для тех клеток, которые были интегрированы в примордиум около P4, зеленый для тех, которые были в IPR, и фиолетовый для тех, которые участвовали в обоих процессах (рис. 7a–c). В момент t0 (0 ч) 1–2 слоя клеток IPR были видны перед P4 (рис. 7a). Как и ожидалось, когда эти клетки делились, они делали это в основном через поперечную плоскость деления (рис. 7a–c). Аналогичные результаты были получены с использованием Col-0 SAM (фокусируясь на P3, чья граница складывается аналогично P4 в Ler), хотя в этом генотипе складка, образованная на цветочной границе, скрывала клетки IPR быстрее (рис. 7g–i). Таким образом, схема деления клеток IPR предварительно организует клетки в радиальные ряды, как в междоузлиях. Организация радиальных рядов и локализация клеток IPR между последовательными органами предполагают, что эти клетки являются междоузлиями-предшественниками.
Здесь мы разработали ратиометрический биосенсор сигнализации GA, qmRGA, который позволяет количественно картировать активность сигнализации GA, возникающую в результате комбинированных концентраций GA и рецепторов GA, при этом минимизируя помехи эндогенным сигнальным путям, тем самым предоставляя информацию о функции GA на клеточном уровне. С этой целью мы сконструировали модифицированный белок DELLA, mRGA, который утратил способность связывать партнеров взаимодействия DELLA, но остается чувствительным к протеолизу, вызванному GA. qmRGA реагирует как на экзогенные, так и на эндогенные изменения уровней GA, а его динамические сенсорные свойства позволяют оценивать пространственно-временные изменения активности сигнализации GA во время развития. qmRGA также является очень гибким инструментом, поскольку его можно адаптировать к различным тканям, изменяя промотор, используемый для его экспрессии (при необходимости), и, учитывая консервативную природу пути сигнализации GA и мотива PFYRE у покрытосеменных, его, вероятно, можно будет переносить на другие виды22. В соответствии с этим, эквивалентная мутация в белке DELLA риса SLR1 (HYY497AAA) также подавляет активность репрессора роста SLR1, при этом лишь немного снижая его деградацию, опосредованную GA, подобно mRGA23. Примечательно, что недавние исследования на Arabidopsis показали, что мутация одной аминокислоты в домене PFYRE (S474L) изменила транскрипционную активность RGA, не влияя на его способность взаимодействовать с партнерами по факторам транскрипции50. Хотя эта мутация очень близка к 3 заменам аминокислот, присутствующим в mRGA, наши исследования показывают, что эти две мутации изменяют различные характеристики DELLA. Хотя большинство партнеров по факторам транскрипции связываются с доменами LHR1 и SAW DELLA26,51, некоторые консервативные аминокислоты в домене PFYRE могут помочь стабилизировать эти взаимодействия.
Развитие междоузлий является ключевым признаком в архитектуре растений и улучшении урожайности. qmRGA выявил более высокую активность сигнализации GA в клетках-предшественниках междоузлий IPR. Объединив количественную визуализацию и генетику, мы показали, что паттерны сигнализации GA накладываются на круговые/поперечные плоскости деления клеток в эпидермисе SAM, формируя организацию деления клеток, необходимую для развития междоузлий. В ходе развития было идентифицировано несколько регуляторов ориентации плоскости деления клеток52,53. Наша работа дает наглядный пример того, как активность сигнализации GA регулирует этот клеточный параметр. DELLA может взаимодействовать с комплексами префолдинговых белков41, поэтому сигнализация GA может регулировать ориентацию плоскости деления клеток, напрямую влияя на ориентацию кортикальных микротрубочек40,41,54,55. Мы неожиданно показали, что в SAM коррелятом более высокой активности сигнализации GA было не удлинение или деление клеток, а только анизотропия роста, что согласуется с прямым влиянием GA на направление деления клеток в IPR. Однако мы не можем исключить, что этот эффект может быть также косвенным, например, опосредованным размягчением клеточной стенки, вызванным GA56. Изменения свойств клеточной стенки вызывают механический стресс57,58, который также может влиять на ориентацию плоскости деления клеток, влияя на ориентацию кортикальных микротрубочек39,46,59. Совместные эффекты механического стресса, вызванного GA, и прямой регуляции ориентации микротрубочек GA могут быть вовлечены в создание специфического рисунка ориентации деления клеток в IPR для определения междоузлий, и необходимы дальнейшие исследования для проверки этой идеи. Аналогичным образом, предыдущие исследования подчеркнули важность взаимодействующих с DELLA белков TCP14 и 15 в контроле образования междоузлий60,61, и эти факторы могут опосредовать действие GA вместе с BREVIPEDICELLUS (BP) и PENNYWISE (PNY), которые регулируют развитие междоузлий и, как было показано, влияют на сигнализацию GA2,62. Учитывая, что DELLA взаимодействуют с сигнальными путями брассиностероидов, этилена, жасмоновой кислоты и абсцизовой кислоты (АБК)63,64 и что эти гормоны могут влиять на ориентацию микротрубочек65, влияние ГА на ориентацию деления клеток может также опосредоваться другими гормонами.
Ранние цитологические исследования показали, что как внутренние, так и внешние области SAM Arabidopsis необходимы для развития междоузлий2,42. Тот факт, что GA активно регулирует клеточное деление во внутренних тканях12, подтверждает двойную функцию GA в регуляции размера меристемы и междоузлий в SAM. Модель направленного деления клеток также строго регулируется во внутренней ткани SAM, и эта регуляция необходима для роста стебля52. Будет интересно изучить, играет ли GA также роль в ориентации плоскости деления клеток во внутренней организации SAM, тем самым синхронизируя спецификацию и развитие междоузлий в пределах SAM.
Растения выращивали in vitro в почве или среде 1x Мурасиге-Скуга (MS) (Duchefa) с добавлением 1% сахарозы и 1% агара (Sigma) в стандартных условиях (16 ч света, 22 °C), за исключением экспериментов по росту гипокотиля и корней, в которых сеянцы выращивали на вертикальных пластинах при постоянном освещении и температуре 22 °C. Для экспериментов с нитратами растения выращивали на модифицированной среде MS (среда для растений bioWORLD) с добавлением адекватного количества нитрата (0 или 10 мМ KNO3), 0,5 мМ NH4-сукцината, 1% сахарозы и 1% А-агара (Sigma) в условиях длинного дня.
ДНК GID1a, вставленная в pDONR221, была рекомбинирована с pDONR P4-P1R-pUBQ10 и pDONR P2R-P3-mCherry в pB7m34GW для создания pUBQ10::GID1a-mCherry. ДНК IDD2, вставленная в pDONR221, была рекомбинирована в pB7RWG266 для создания p35S:IDD2-RFP. Для создания pGID1b::2xmTQ2-GID1b фрагмент размером 3,9 кб выше кодирующей области GID1b и фрагмент размером 4,7 кб, содержащий кДНК GID1b (1,3 кб) и терминатор (3,4 кб), были сначала амплифицированы с использованием праймеров в Дополнительной таблице 3, а затем вставлены в pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) и pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) соответственно, и, наконец, рекомбинированы с pDONR221 2xmTQ268 в целевой вектор pGreen 012567 с использованием клонирования Gateway. Для создания pCUC2::LSSmOrange последовательность промотора CUC2 (3229 п.н. выше ATG), за которой следовала кодирующая последовательность большого смещенного Стокса mOrange (LSSmOrange)69 с сигналом ядерной локализации N7 и терминатором транскрипции NOS, были собраны в вектор таргетинга канамицина pGreen с использованием системы рекомбинации Gateway 3-fragment (Invitrogen). Растительный бинарный вектор был введен в штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101 и введен в листья Nicotiana benthamiana методом инфильтрации Agrobacterium и в Arabidopsis thaliana Col-0 методом погружения в цветки, соответственно. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry и pCLV3::mCherry-NLS qmRGA были выделены из потомков F3 и F1 соответствующих скрещиваний, соответственно.
Гибридизация РНК in situ проводилась на кончиках побегов длиной около 1 см72, которые собирались и немедленно фиксировались в растворе FAA (3,7% формальдегида, 5% уксусной кислоты, 50% этанола), предварительно охлажденном до 4 °C. После 2 × 15-минутных вакуумных обработок фиксатор менялся, и образцы инкубировались в течение ночи. КДНК GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 и RGL3 и антисмысловые зонды к их 3′-UTR синтезировались с использованием праймеров, показанных в дополнительной таблице 3, как описано Розье и др.73. Зонды, меченые дигоксигенином, были иммунодетектированы с использованием антител к дигоксигенину (3000-кратное разведение; Roche, номер по каталогу: 11 093 274 910), а срезы были окрашены раствором 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата (BCIP, 250-кратное разведение)/нитросинего тетразолия (NBT, 200-кратное разведение).
Время публикации: 10 февр. 2025 г.