Рост верхушечной меристемы побега (SAM) имеет решающее значение для архитектуры стебля. Растительные гормоныгиббереллиныГибридные аммониевые кислоты (ГА) играют ключевую роль в координации роста растений, но их роль в апикальной меристеме побега (САМ) остается малоизученной. В данной работе мы разработали ратиометрический биосенсор для определения сигналов ГА, модифицировав белок DELLA таким образом, чтобы подавить его важную регуляторную функцию в транскрипционном ответе на ГА, сохраняя при этом его деградацию при распознавании ГА. Мы показали, что этот биосенсор, основанный на деградации, точно регистрирует изменения уровней ГА и клеточной сенсорики в процессе развития. Мы использовали этот биосенсор для картирования активности сигналов ГА в САМ. Мы показали, что высокие сигналы ГА присутствуют преимущественно в клетках, расположенных между зачатками органов, которые являются предшественниками клеток междоузлий. Используя подходы усиления и подавления функции, мы дополнительно продемонстрировали, что ГА регулирует ориентацию плоскости клеточного деления, устанавливая каноническую клеточную организацию междоузлий, тем самым способствуя спецификации междоузлий в САМ.
Верхушечная меристема побега (ВМП), расположенная на верхушке побега, содержит нишу стволовых клеток, активность которых модульным и итеративным образом генерирует боковые органы и узлы стебля на протяжении всей жизни растения. Каждая из этих повторяющихся единиц, или узлов растения, включает междоузлия и боковые органы в узлах, а также пазушные меристемы в пазухах листьев¹. Рост и организация узлов растения изменяются в процессе развития. У Arabidopsis рост междоузлий подавляется на вегетативной стадии, а пазушные меристемы остаются в состоянии покоя в пазухах розеточных листьев. Во время перехода к цветочной фазе ВМП становится меристемой соцветия, генерируя удлиненные междоузлия и пазушные почки, веточки в пазухах стеблевых листьев, а позже — безлистные цветки². Хотя мы добились значительного прогресса в понимании механизмов, контролирующих закладку листьев, цветков и ветвей, относительно мало известно о том, как возникают междоузлия.
Понимание пространственно-временного распределения ГА поможет лучше понять функции этих гормонов в разных тканях и на разных стадиях развития. Визуализация деградации гибридного белка RGA-GFP, экспрессируемого под действием собственного промотора, предоставляет важную информацию о регуляции общего уровня ГА в корнях15,16. Однако экспрессия RGA варьируется в разных тканях17 и регулируется ГА18. Таким образом, дифференциальная экспрессия промотора RGA может приводить к наблюдаемому флуоресцентному паттерну с RGA-GFP, и поэтому этот метод не является количественным. Недавно биоактивный флуоресцеин (Fl)-меченый ГА19,20 выявил накопление ГА в эндокортексе корня и регуляцию его клеточного уровня посредством транспорта ГА. Недавно сенсор GA FRET nlsGPS1 показал, что уровни ГА коррелируют с удлинением клеток в корнях, нитях и гипокотилях, выращенных в темноте21. Однако, как мы уже видели, концентрация ГА не является единственным параметром, контролирующим активность ГА-сигнализации, поскольку она зависит от сложных процессов распознавания. В данной работе, опираясь на наше понимание сигнальных путей DELLA и ГА, мы представляем разработку и характеристику ратиометрического биосенсора для ГА-сигнализации, основанного на деградации. Для разработки этого количественного биосенсора мы использовали мутантный ГА-чувствительный RGA, который был слит с флуоресцентным белком и повсеместно экспрессировался в тканях, а также ГА-нечувствительный флуоресцентный белок. Мы показали, что слияния мутантного белка RGA не мешают эндогенной ГА-сигнализации при его повсеместной экспрессии, и что этот биосенсор может количественно определять активность сигнализации, возникающую как в результате поступления ГА, так и в результате обработки сигнала ГА сенсорным аппаратом с высоким пространственно-временным разрешением. Мы использовали этот биосенсор для картирования пространственно-временного распределения активности ГА-сигнализации и количественной оценки того, как ГА регулирует клеточное поведение в эпидермисе SAM. Мы показываем, что ГА регулирует ориентацию плоскости деления клеток САМ, расположенных между зачатками органов, тем самым определяя каноническую клеточную организацию междоузлия.
Наконец, мы задались вопросом, может ли qmRGA регистрировать изменения уровня эндогенного ГА с помощью растущих гипокотилей. Ранее мы показали, что нитрат стимулирует рост, увеличивая синтез ГА и, в свою очередь, деградацию DELLA34. Соответственно, мы наблюдали, что длина гипокотиля у сеянцев pUBQ10::qmRGA, выращенных в условиях обильного поступления нитрата (10 мМ NO3−), была значительно больше, чем у сеянцев, выращенных в условиях дефицита нитрата (дополнительный рис. 6a). В соответствии с реакцией роста, сигналы ГА были выше в гипокотилях сеянцев, выращенных в условиях 10 мМ NO3−, чем у сеянцев, выращенных в отсутствие нитрата (дополнительный рис. 6b, c). Таким образом, qmRGA также позволяет отслеживать изменения в передаче сигналов ГА, вызванные эндогенными изменениями концентрации ГА.
Чтобы понять, зависит ли активность ГА-сигнализации, обнаруженная с помощью qmRGA, от концентрации ГА и восприятия ГА, как и ожидалось, исходя из конструкции сенсора, мы проанализировали экспрессию трех рецепторов GID1 в вегетативных и репродуктивных тканях. В сеянцах репортерная линия GID1-GUS показала, что GID1a и c высоко экспрессируются в семядолях (рис. 3a–c). Кроме того, все три рецептора экспрессировались в листьях, зачатках боковых корней, кончиках корней (за исключением корневого чехлика GID1b) и сосудистой системе (рис. 3a–c). В апикальной меристеме соцветия мы обнаружили сигналы GUS только для GID1b и 1c (дополнительный рис. 7a–c). Гибридизация in situ подтвердила эти закономерности экспрессии и дополнительно продемонстрировала, что GID1c равномерно экспрессируется на низком уровне в апикальной меристеме, тогда как GID1b демонстрирует более высокую экспрессию на периферии апикальной меристемы (дополнительный рис. 7d–l). Трансляционная гибридная конструкция pGID1b::2xmTQ2-GID1b также выявила градуированный диапазон экспрессии GID1b, от низкой или нулевой экспрессии в центре апикальной меристемы побега до высокой экспрессии на границах органа (дополнительный рис. 7m). Таким образом, рецепторы GID1 неравномерно распределены по тканям и внутри них. В последующих экспериментах мы также наблюдали, что сверхэкспрессия GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) повышала чувствительность qmRGA в гипокотилях к внешнему применению ГА (рис. 3d, e). В отличие от этого, флуоресценция, измеренная qd17mRGA в гипокотиле, была нечувствительна к обработке ГА3 (рис. 3f, g). В обоих анализах сеянцы обрабатывали высокими концентрациями ГА (100 мкМ ГА3) для оценки быстрого поведения сенсора, при котором способность связываться с рецептором GID1 усиливалась или терялась. В совокупности эти результаты подтверждают, что биосенсор qmRGA выполняет комбинированную функцию в качестве сенсора GA и GA, и предполагают, что дифференциальная экспрессия рецептора GID1 может значительно модулировать излучательную способность сенсора.
На сегодняшний день распределение сигналов ГА в апикальной меристеме побега остается неясным. Поэтому мы использовали растения, экспрессирующие qmRGA, и репортер стволовых клеток pCLV3::mCherry-NLS35 для расчета высокоточных количественных карт активности сигналов ГА, сосредоточившись на слое L1 (эпидермис; рис. 4a, b, см. Методы и Дополнительные методы), поскольку L1 играет ключевую роль в контроле роста апикальной меристемы побега36. Здесь экспрессия pCLV3::mCherry-NLS обеспечила фиксированную геометрическую точку отсчета для анализа пространственно-временного распределения активности сигналов ГА37. Хотя ГА считается необходимым для развития боковых органов4, мы наблюдали, что сигналы ГА были низкими в цветочном примордии (P), начиная со стадии P3 (рис. 4a, b), тогда как молодые примордии P1 и P2 имели умеренную активность, аналогичную активности в центральной области (рис. 4a, b). Повышенная активность ГА-сигнализации была обнаружена на границах органных зачатков, начиная с P1/P2 (по бокам границы) и достигая пика на P4, а также во всех клетках периферической области, расположенной между зачатками (рис. 4a, b и дополнительный рис. 8a, b). Эта повышенная активность ГА-сигнализации наблюдалась не только в эпидермисе, но и в слоях L2 и верхнем L3 (дополнительный рис. 8b). Характер сигналов ГА, обнаруженных в САМ с использованием qmRGA, также оставался неизменным с течением времени (дополнительный рис. 8c–f, k). Хотя конструкция qd17mRGA была систематически подавлена в САМ растений T3 из пяти независимых линий, которые мы подробно охарактеризовали, мы смогли проанализировать флуоресцентные паттерны, полученные с помощью конструкции pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (дополнительный рис. 8g–j, l). В этой контрольной линии были обнаружены лишь незначительные изменения в соотношении флуоресценции в SAM, но в центре SAM мы наблюдали явное и неожиданное снижение VENUS, связанное с TagBFP. Это подтверждает, что наблюдаемая с помощью qmRGA картина сигнализации отражает зависимую от ГА деградацию mRGA-VENUS, но также демонстрирует, что qmRGA может переоценивать активность сигнализации ГА в центре меристемы. В целом, наши результаты показывают картину сигнализации ГА, которая в первую очередь отражает распределение примордиев. Такое распределение межпримордиальной области (IPR) обусловлено постепенным установлением высокой активности сигнализации ГА между развивающимся примордием и центральной областью, в то время как активность сигнализации ГА в примордие снижается (рис. 4c, d).
Распределение рецепторов GID1b и GID1c (см. выше) предполагает, что дифференциальная экспрессия рецепторов ГА помогает формировать характер активности ГА-сигнализации в САМ. Мы задались вопросом, может ли быть задействовано дифференциальное накопление ГА. Для исследования этой возможности мы использовали ГА-FRET-сенсор nlsGPS121. В САМ nlsGPS1, обработанном 10 мкМ GA4+7 в течение 100 мин, было обнаружено увеличение частоты активации (дополнительный рис. 9a–e), что указывает на то, что nlsGPS1 реагирует на изменения концентрации ГА в САМ, как и в корнях21. Пространственное распределение частоты активации nlsGPS1 показало относительно низкий уровень ГА во внешних слоях САМ, но выявило его повышение в центре и на границах САМ (рис. 4e и дополнительный рис. 9a,c). Это позволяет предположить, что ГА также распределяется в САМ с пространственным рисунком, сопоставимым с тем, который был выявлен с помощью qmRGA. В качестве дополнительного подхода мы также обработали САМ флуоресцентным ГА (GA3-, GA4-, GA7-Fl) или только Fl в качестве отрицательного контроля. Сигнал Fl был распределен по всей САМ, включая центральную область и примордий, хотя и с меньшей интенсивностью (рис. 4j и дополнительный рис. 10d). В отличие от этого, все три GA-Fl накапливались специфически в пределах границ примордия и в различной степени в остальной части ИПР, при этом GA7-Fl накапливался в самом большом домене в ИПР (рис. 4k и дополнительный рис. 10a,b). Количественная оценка интенсивности флуоресценции показала, что отношение интенсивности IPR к интенсивности не-IPR было выше в SAM, обработанных GA-Fl, по сравнению с SAM, обработанными Fl (рис. 4l и дополнительный рис. 10c). В совокупности эти результаты предполагают, что GA присутствует в более высоких концентрациях в клетках IPR, расположенных ближе всего к границе органа. Это говорит о том, что характер активности GA-сигнализации в SAM обусловлен как дифференциальной экспрессией рецепторов GA, так и дифференциальным накоплением GA в клетках IPR вблизи границ органа. Таким образом, наш анализ выявил неожиданный пространственно-временной характер GA-сигнализации, с более низкой активностью в центре и зачатке SAM и более высокой активностью в IPR в периферической области.
Чтобы понять роль дифференциальной активности сигнального пути ГА в апикальной меристеме побега (SAM), мы проанализировали корреляцию между активностью сигнального пути ГА, расширением клеток и делением клеток, используя покадровую съемку SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS в реальном времени. Учитывая роль ГА в регуляции роста, ожидалась положительная корреляция с параметрами расширения клеток. Поэтому мы сначала сравнили карты активности сигнального пути ГА с картами скорости роста клеточной поверхности (как показатель силы расширения клеток для данной клетки и для дочерних клеток при делении) и с картами анизотропии роста, которая измеряет направленность расширения клеток (также используемыми здесь для данной клетки и для дочерних клеток при делении; рис. 5a,b, см. Методы и Дополнительные методы). Наши карты скорости роста клеточной поверхности SAM согласуются с предыдущими наблюдениями38,39, демонстрируя минимальные темпы роста на границе и максимальные темпы роста в развивающихся цветках (рис. 5a). Анализ главных компонентов (PCA) показал, что активность ГА-сигнализации отрицательно коррелирует с интенсивностью роста клеточной поверхности (рис. 5c). Мы также показали, что основные оси вариации, включая входной сигнал ГА-сигнализации и интенсивность роста, ортогональны направлению, определяемому высокой экспрессией CLV3, что подтверждает исключение клеток из центра SAM в оставшихся анализах. Корреляционный анализ Спирмена подтвердил результаты PCA (рис. 5d), указывая на то, что более высокие сигналы ГА в IPR не приводят к большему расширению клеток. Однако корреляционный анализ выявил слабую положительную корреляцию между активностью ГА-сигнализации и анизотропией роста (рис. 5c, d), предполагая, что более высокая ГА-сигнализация в IPR влияет на направление роста клеток и, возможно, на положение плоскости клеточного деления.
a, b Тепловые карты среднего роста поверхности (a) и анизотропии роста (b) в САМ, усредненные по семи независимым растениям (используемым в качестве индикаторов силы и направления роста клеток соответственно). c Анализ главных компонентов (PCA) включал следующие переменные: сигнал ГА, интенсивность роста поверхности, анизотропия роста поверхности и экспрессия CLV3. Компонент 1 PCA в основном отрицательно коррелировал с интенсивностью роста поверхности и положительно коррелировал с сигналом ГА. Компонент 2 PCA в основном положительно коррелировал с анизотропией роста поверхности и отрицательно коррелировал с экспрессией CLV3. Проценты представляют вариацию, объясняемую каждым компонентом. d Корреляционный анализ Спирмена между сигналом ГА, интенсивностью роста поверхности и анизотропией роста поверхности в масштабе ткани, за исключением CZ. Число справа — значение коэффициента корреляции Спирмена между двумя переменными. Звездочками отмечены случаи, когда корреляция/отрицательная корреляция является высокозначимой. e 3D-визуализация клеток Col-0 SAM L1 с помощью конфокальной микроскопии. Новые клеточные стенки, образовавшиеся в апикальной меристеме побега (но не в зачатке) через 10 часов, окрашены в соответствии с их угловыми значениями. Цветовая шкала показана в правом нижнем углу. На вставке показано соответствующее 3D-изображение через 0 часов. Эксперимент был повторен дважды с аналогичными результатами. f Диаграммы размаха отображают скорость деления клеток в апикальной меристеме побега Col-0 с IPR и без IPR (n = 10 независимых растений). Центральная линия показывает медиану, а границы прямоугольника указывают 25-й и 75-й процентили. Усы показывают минимальное и максимальное значения, определенные с помощью программного обеспечения R. Значения P были получены с помощью двухстороннего t-критерия Уэлча. g, h Схематическое изображение, показывающее (g) как измерить угол новой клеточной стенки (пурпурный) относительно радиального направления от центра САМ (белая пунктирная линия) (рассматриваются только значения острого угла, т.е. 0–90°), и (h) окружное/латеральное и радиальное направления внутри меристемы. i Гистограммы частот ориентации плоскости клеточного деления по САМ (темно-синий), IPR (средне-синий) и не-IPR (светло-синий) соответственно. Значения P были получены с помощью двустороннего теста Колмогорова-Смирнова. Эксперимент был повторен дважды с аналогичными результатами. j Гистограммы частот ориентации плоскости клеточного деления IPR вокруг P3 (светло-зеленый), P4 (средне-зеленый) и P5 (темно-зеленый) соответственно. Значения P были получены с помощью двустороннего теста Колмогорова-Смирнова. Эксперимент был повторен дважды с аналогичными результатами.
Поэтому далее мы исследовали корреляцию между сигнализацией ГА и активностью клеточного деления, идентифицируя вновь образованные клеточные стенки в ходе анализа (рис. 5e). Этот подход позволил нам измерить частоту и направление клеточного деления. Удивительно, но мы обнаружили, что частота клеточных делений в IPR и остальной части SAM (не-IPR, рис. 5f) была схожей, что указывает на то, что различия в сигнализации ГА между клетками IPR и не-IPR не оказывают существенного влияния на клеточное деление. Это, а также положительная корреляция между сигнализацией ГА и анизотропией роста, побудили нас рассмотреть вопрос о том, может ли активность сигнализации ГА влиять на ориентацию плоскости клеточного деления. Мы измерили ориентацию новой клеточной стенки как острый угол относительно радиальной оси, соединяющей центр меристемы и центр новой клеточной стенки (рис. 5e-i) и наблюдали явную тенденцию к делению клеток под углами, близкими к 90° относительно радиальной оси, с наибольшей частотой при 70–80° (23,28%) и 80–90° (22,62%) (рис. 5e,i), что соответствует делению клеток в окружном/поперечном направлении (рис. 5h). Чтобы изучить вклад сигнализации ГА в это поведение клеточного деления, мы проанализировали параметры клеточного деления отдельно в IPR и не-IPR (рис. 5i). Мы обнаружили, что распределение углов деления в клетках IPR отличалось от такового в клетках, не относящихся к IPR, или в клетках всей апикальной меристемы побега (SAM), при этом клетки IPR демонстрировали более высокую долю латеральных/круговых делений, т.е. 70–80° и 80–90° (33,86% и 30,71% соответственно, соответствующие доли) (рис. 5i). Таким образом, наши наблюдения выявили связь между высокой активностью ГА-сигнализации и ориентацией плоскости деления клеток, близкой к окружному направлению, аналогично корреляции между активностью ГА-сигнализации и анизотропией роста (рис. 5c, d). Для дальнейшего подтверждения пространственной консервации этой связи мы измерили ориентацию плоскости деления в клетках IPR, окружающих примордий, начиная с P3, поскольку самая высокая активность ГА-сигнализации была обнаружена в этой области, начиная с P4 (рис. 4). Углы деления IPR в области P3 и P4 не показали статистически значимых различий, хотя в IPR в области P4 наблюдалось увеличение частоты латеральных делений клеток (рис. 5j). Однако в клетках IPR в области P5 разница в ориентации плоскости деления клеток стала статистически значимой, с резким увеличением частоты поперечных делений клеток (рис. 5j). В совокупности эти результаты предполагают, что сигнализация GA может контролировать ориентацию деления клеток в SAM, что согласуется с предыдущими сообщениями40,41 о том, что высокая сигнализация GA может индуцировать латеральную ориентацию деления клеток в IPR.
Предполагается, что клетки в междоузлиях будут включаться не в зачатки, а в междоузлия2,42,43. Поперечная ориентация клеточных делений в междоузлиях может приводить к типичной организации параллельных продольных рядов эпидермальных клеток в междоузлиях. Наши наблюдения, описанные выше, позволяют предположить, что сигнализация ГА, вероятно, играет роль в этом процессе, регулируя направление клеточного деления.
Потеря функции нескольких генов DELLA приводит к конститутивному ответу на ГА, и мутанты della могут быть использованы для проверки этой гипотезы44. Сначала мы проанализировали паттерны экспрессии пяти генов DELLA в апикальной меристеме побега (SAM). Транскрипционное слияние линии GUS45 показало, что гены GAI, RGA, RGL1 и RGL2 (в значительно меньшей степени) экспрессируются в SAM (дополнительный рис. 11a–d). Гибридизация in situ дополнительно продемонстрировала, что мРНК GAI накапливается специфически в примордиях и развивающихся цветках (дополнительный рис. 11e). мРНК RGL1 и RGL3 были обнаружены по всему пологу SAM и в более старых цветках, тогда как мРНК RGL2 была более обильна в пограничной области (дополнительный рис. 11f–h). Конфокальная микроскопия SAM pRGL3::RGL3-GFP подтвердила экспрессию, наблюдаемую методом гибридизации in situ, и показала, что белок RGL3 накапливается в центральной части SAM (дополнительный рис. 11i). Используя линию pRGA::GFP-RGA, мы также обнаружили, что белок RGA накапливается в SAM, но его количество уменьшается на границе, начиная с P4 (дополнительный рис. 11j). Примечательно, что паттерны экспрессии RGL3 и RGA согласуются с более высокой активностью GA-сигнализации в IPR, как было обнаружено с помощью qmRGA (рис. 4). Более того, эти данные указывают на то, что все DELLA экспрессируются в SAM и что их экспрессия в совокупности охватывает всю SAM.
Далее мы проанализировали параметры клеточного деления в САМ дикого типа (Ler, контроль) и в пятикратных (глобальных) мутантах gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della (рис. 6a, b). Интересно, что мы наблюдали статистически значимый сдвиг в распределении частоты углов клеточного деления в САМ глобального мутанта della по сравнению с диким типом (рис. 6c). Это изменение в глобальном мутанте della было обусловлено увеличением частоты углов 80–90° (34,71% против 24,55%) и, в меньшей степени, углов 70–80° (23,78% против 20,18%), т.е. соответствующих поперечному клеточному делению (рис. 6c). Частота непоперечных делений (0–60°) также была ниже у мутанта della global (рис. 6c). Частота поперечных делений клеток была значительно повышена в САМ мутанта della global (рис. 6b). Частота поперечных делений клеток в IPR также была выше у мутанта della global по сравнению с диким типом (рис. 6d). За пределами области IPR у дикого типа наблюдалось более равномерное распределение углов деления клеток, тогда как мутант della global предпочитал тангенциальные деления, как в IPR (рис. 6e). Мы также количественно оценили ориентацию делений клеток в САМ пятикратных мутантов ga2-оксидазы (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 и ga2ox6-2), мутантного фона с неактивной ГА, в котором накапливается ГА. В соответствии с увеличением уровня ГА, апикальная меристема побега (SAM) пятерного мутанта ga2ox была больше, чем у Col-0 (дополнительный рис. 12a, b), и по сравнению с Col-0, SAM пятерного мутанта ga2ox демонстрировала отчетливо различное распределение углов деления клеток, при этом частота углов увеличивалась от 50° до 90°, то есть снова отдавала предпочтение тангенциальным делениям (дополнительный рис. 12a–c). Таким образом, мы показываем, что конститутивная активация ГА-сигнализации и накопление ГА индуцируют латеральное деление клеток в IPR и остальной части SAM.
a, b 3D-визуализация слоя L1 окрашенного PI мутанта Ler (a) и глобального мутанта della (b) с использованием конфокальной микроскопии. Показаны новые клеточные стенки, образовавшиеся в SAM (но не в зачатке) в течение 10 часов, и окрашены в соответствии с их угловыми значениями. На вставке показан SAM в момент времени 0 ч. Цветовая шкала отображается в правом нижнем углу. Стрелка на рисунке (b) указывает на пример выровненных рядов клеток в глобальном мутанте della. Эксперимент был повторен дважды с аналогичными результатами. Сравнение частотного распределения ориентаций плоскостей деления клеток во всем SAM (d), IPR (e) и не-IPR (f) между Ler и глобальным мутантом della. Значения P были получены с использованием двустороннего теста Колмогорова-Смирнова. f, g 3D-визуализация конфокальных изображений окрашенной PI апикальной меристемы побега (SAM) трансгенных растений Col-0 (i) и pCUC2::gai-1-VENUS (j). Панели (a, b) показывают новые клеточные стенки (но не зачатки), образовавшиеся в SAM в течение 10 часов. Эксперимент был повторен дважды с аналогичными результатами. h–j Сравнение частотного распределения ориентаций плоскостей деления клеток, расположенных во всей SAM (h), IPR (i) и не-IPR (j), между растениями Col-0 и pCUC2::gai-1-VENUS. Значения P были получены с использованием двустороннего теста Колмогорова-Смирнова.
Далее мы исследовали эффект ингибирования ГА-сигнализации именно в IPR. Для этого мы использовали промотор cotyledon cup 2 (CUC2) для управления экспрессией доминантного негативного белка gai-1, слитого с VENUS (в линии pCUC2::gai-1-VENUS). В SAM дикого типа промотор CUC2 управляет экспрессией большинства IPR в SAM, включая краевые клетки, начиная с P4, и аналогичная специфическая экспрессия наблюдалась в растениях pCUC2::gai-1-VENUS (см. ниже). Распределение углов деления клеток по SAM или IPR растений pCUC2::gai-1-VENUS существенно не отличалось от такового у дикого типа, хотя неожиданно мы обнаружили, что клетки без IPR в этих растениях делились с более высокой частотой 80–90° (рис. 6f–j).
Было высказано предположение, что направление деления клеток зависит от геометрии САМ, в частности от растягивающего напряжения, создаваемого кривизной ткани46. Поэтому мы задались вопросом, изменяется ли форма САМ у мутанта della global и растений pCUC2::gai-1-VENUS. Как сообщалось ранее12, размер САМ у мутанта della global был больше, чем у дикого типа (дополнительный рис. 13a, b, d). Гибридизация in situ РНК CLV3 и STM подтвердила расширение меристемы у мутантов della и дополнительно показала латеральное расширение ниши стволовых клеток (дополнительный рис. 13e, f, h, i). Однако кривизна САМ была одинаковой у обоих генотипов (дополнительный рис. 13k, m, n, p). Мы наблюдали аналогичное увеличение размера у четверного мутанта gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della без изменения кривизны по сравнению с диким типом (дополнительные рис. 13c, d, g, j, l, o, p). Частота ориентации клеточного деления также была затронута у четверного мутанта della, но в меньшей степени, чем у монолитного мутанта della (дополнительные рис. 12d–f). Этот дозовый эффект, наряду с отсутствием влияния на кривизну, предполагает, что остаточная активность RGL3 в четверном мутанте Della ограничивает изменения ориентации клеточного деления, вызванные потерей активности DELLA, и что изменения в боковом клеточном делении происходят в ответ на изменения активности сигнального пути GA, а не на изменения геометрии SAM. Как описано выше, промотор CUC2 управляет экспрессией IPR в SAM, начиная с P4 (дополнительный рис. 14a, b), и, напротив, SAM pCUC2::gai-1-VENUS имел уменьшенный размер, но большую кривизну (дополнительный рис. 14c–h). Это изменение морфологии SAM pCUC2::gai-1-VENUS может привести к различному распределению механических напряжений по сравнению с диким типом, в котором высокие окружные напряжения начинаются на меньшем расстоянии от центра SAM47. В качестве альтернативы, изменения морфологии SAM pCUC2::gai-1-VENUS могут быть результатом изменений региональных механических свойств, вызванных экспрессией трансгена48. В обоих случаях это может частично компенсировать эффекты изменений в передаче сигналов GA, увеличивая вероятность того, что клетки будут делиться в окружной/поперечной ориентации, что объясняет наши наблюдения.
В совокупности наши данные подтверждают, что более высокая активность сигнального пути ГА играет активную роль в латеральной ориентации плоскости клеточного деления в IPR. Они также показывают, что кривизна меристемы также влияет на ориентацию плоскости клеточного деления в IPR.
Поперечная ориентация плоскости деления в IPR, обусловленная высокой активностью сигнального пути ГА, предполагает, что ГА предварительно организует радиальный ряд клеток в эпидермисе внутри SAM, определяя клеточную организацию, которая впоследствии будет обнаружена в междоузлиях эпидермиса. Действительно, такие ряды клеток часто были видны на изображениях SAM мутантов della global (рис. 6b). Таким образом, для дальнейшего изучения функции пространственного паттерна сигнального пути ГА в SAM в процессе развития мы использовали покадровую съемку для анализа пространственной организации клеток в IPR у растений дикого типа (Ler и Col-0), мутантов della global и трансгенных растений pCUC2::gai-1-VENUS.
Мы обнаружили, что qmRGA показал, что активность ГА-сигнализации в IPR увеличивалась от P1/P2 и достигала пика на P4, и эта закономерность оставалась постоянной с течением времени (рис. 4a–f и дополнительные рис. 8c–f, k). Для анализа пространственной организации клеток в IPR с увеличением сигнала ГА мы пометили клетки Ler IPR выше и по бокам от P4 в соответствии с их судьбой развития, проанализированной через 34 часа после первого наблюдения, то есть более чем через два периода развития пластид, что позволило нам проследить за клетками IPR во время развития примордия от P1/P2 до P4. Мы использовали три разных цвета: желтый для клеток, интегрированных в примордий вблизи P4, зеленый для клеток, находящихся в IPR, и фиолетовый для клеток, участвующих в обоих процессах (рис. 7a–c). В момент времени t0 (0 ч) перед P4 были видны 1–2 слоя клеток IPR (рис. 7a). Как и ожидалось, деление этих клеток происходило преимущественно в поперечной плоскости (рис. 7a–c). Аналогичные результаты были получены с использованием SAM Col-0 (с акцентом на P3, граница которого складывается аналогично P4 у Ler), хотя у этого генотипа складка, образующаяся на границе цветка, быстрее скрывала клетки IPR (рис. 7g–i). Таким образом, характер деления клеток IPR предварительно организует клетки в радиальные ряды, как в междоузлиях. Организация радиальных рядов и локализация клеток IPR между последовательными органами позволяют предположить, что эти клетки являются междоузлиевыми предшественниками.
В данной работе мы разработали ратиометрический биосенсор для ГА-сигнализации, qmRGA, который позволяет количественно картировать активность ГА-сигнализации, возникающую в результате комбинированных концентраций ГА и рецепторов ГА, минимизируя при этом помехи эндогенным сигнальным путям, тем самым предоставляя информацию о функции ГА на клеточном уровне. Для этого мы сконструировали модифицированный белок DELLA, mRGA, который утратил способность связываться с партнерами по взаимодействию DELLA, но остается чувствительным к протеолизу, индуцированному ГА. qmRGA реагирует как на экзогенные, так и на эндогенные изменения уровней ГА, а его динамические сенсорные свойства позволяют оценивать пространственно-временные изменения активности ГА-сигнализации в процессе развития. qmRGA также является очень гибким инструментом, поскольку его можно адаптировать к различным тканям, изменяя промотор, используемый для его экспрессии (при необходимости), и, учитывая консервативный характер сигнального пути ГА и мотива PFYRE у покрытосеменных растений, он, вероятно, может быть перенесен на другие виды22. В соответствии с этим, эквивалентная мутация в белке DELLA риса SLR1 (HYY497AAA) также подавляет активность репрессора роста SLR1, лишь незначительно снижая его опосредованную ГА деградацию, подобно mRGA23. Примечательно, что недавние исследования на Arabidopsis показали, что единственная аминокислотная мутация в домене PFYRE (S474L) изменяет транскрипционную активность RGA, не влияя на его способность взаимодействовать с партнерами-транскрипционными факторами50. Хотя эта мутация очень близка к трем аминокислотным заменам, присутствующим в mRGA, наши исследования показывают, что эти две мутации изменяют различные характеристики DELLA. Хотя большинство партнеров-транскрипционных факторов связываются с доменами LHR1 и SAW DELLA26,51, некоторые консервативные аминокислоты в домене PFYRE могут способствовать стабилизации этих взаимодействий.
Развитие междоузлий является ключевым признаком архитектуры растений и повышения урожайности. Метод qmRGA выявил более высокую активность ГА-сигнализации в клетках-предшественниках междоузлий IPR. Комбинируя количественную визуализацию и генетику, мы показали, что паттерны ГА-сигнализации накладываются друг на друга по кольцевым/поперечным плоскостям клеточного деления в эпидермисе SAM, формируя организацию клеточного деления, необходимую для развития междоузлий. В процессе развития было выявлено несколько регуляторов ориентации плоскости клеточного деления52,53. Наша работа представляет собой наглядный пример того, как активность ГА-сигнализации регулирует этот клеточный параметр. DELLA может взаимодействовать с комплексами префолдинговых белков41, поэтому ГА-сигнализация может регулировать ориентацию плоскости клеточного деления, непосредственно влияя на ориентацию кортикальных микротрубочек40,41,54,55. Мы неожиданно показали, что в SAM коррелятом более высокой активности ГА-сигнализации является не удлинение или деление клеток, а только анизотропия роста, что согласуется с прямым влиянием ГА на направление клеточного деления в IPR. Однако мы не можем исключить, что этот эффект может быть и косвенным, например, опосредованным размягчением клеточной стенки, вызванным ГА56. Изменения свойств клеточной стенки вызывают механическое напряжение57,58, которое также может влиять на ориентацию плоскости клеточного деления, воздействуя на ориентацию кортикальных микротрубочек39,46,59. Совместное воздействие механического напряжения, вызванного ГА, и прямой регуляции ориентации микротрубочек с помощью ГА может быть связано с формированием специфического паттерна ориентации клеточного деления в IPR для определения междоузлий, и для проверки этой идеи необходимы дальнейшие исследования. Аналогично, предыдущие исследования подчеркнули важность взаимодействующих с DELLA белков TCP14 и 15 в контроле формирования междоузлий60,61, и эти факторы могут опосредовать действие ГА вместе с BREVIPEDICELLUS (BP) и PENNYWISE (PNY), которые регулируют развитие междоузлий и, как было показано, влияют на сигнализацию ГА2,62. Учитывая, что DELLA взаимодействуют с сигнальными путями брассиностероидов, этилена, жасмоновой кислоты и абсцизовой кислоты (АБК)63,64, и что эти гормоны могут влиять на ориентацию микротрубочек65, эффекты ГА на ориентацию клеточного деления могут также опосредоваться другими гормонами.
Ранние цитологические исследования показали, что как внутренние, так и внешние области апикальной меристемы побега (SAM) Arabidopsis необходимы для развития междоузлий2,42. Тот факт, что ГА активно регулирует деление клеток во внутренних тканях12, подтверждает двойную функцию ГА в регулировании размера меристемы и междоузлий в SAM. Схема направленного деления клеток также жестко регулируется во внутренней ткани SAM, и эта регуляция необходима для роста стебля52. Будет интересно изучить, играет ли ГА также роль в ориентации плоскости деления клеток во внутренней организации SAM, тем самым синхронизируя спецификацию и развитие междоузлий внутри SAM.
Растения выращивали in vitro в почве или на 1x среде Мурасиге-Скога (MS) (Duchefa), дополненной 1% сахарозы и 1% агара (Sigma), в стандартных условиях (16 часов света, 22 °C), за исключением экспериментов по росту гипокотиля и корней, в которых сеянцы выращивали на вертикальных пластинах при постоянном освещении и температуре 22 °C. Для экспериментов с нитратами растения выращивали на модифицированной среде MS (растительная среда bioWORLD), дополненной достаточным количеством нитрата (0 или 10 мМ KNO3), 0,5 мМ NH4-сукцината, 1% сахарозы и 1% А-агара (Sigma) в условиях длинного светового дня.
КДНК GID1a, вставленная в pDONR221, была рекомбинирована с pDONR P4-P1R-pUBQ10 и pDONR P2R-P3-mCherry в pB7m34GW для получения pUBQ10::GID1a-mCherry. ДНК IDD2, вставленная в pDONR221, была рекомбинирована в pB7RWG266 для получения p35S:IDD2-RFP. Для создания pGID1b::2xmTQ2-GID1b сначала амплифицировали фрагмент длиной 3,9 кб, расположенный выше кодирующей области GID1b, и фрагмент длиной 4,7 кб, содержащий кДНК GID1b (1,3 кб) и терминатор (3,4 кб), используя праймеры из дополнительной таблицы 3, а затем вставляли в pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) и pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) соответственно, и, наконец, рекомбинировали с pDONR221 2xmTQ268 в целевой вектор pGreen 012567 с использованием клонирования Gateway. Для создания pCUC2::LSSmOrange последовательность промотора CUC2 (3229 п.н. выше ATG), за которой следует кодирующая последовательность большого сдвинутого по Стоксу mOrange (LSSmOrange)69 с сигналом ядерной локализации N7 и транскрипционным терминатором NOS, была собрана в вектор pGreen для направленного воздействия на канамицин с использованием системы рекомбинации фрагментов Gateway (Invitrogen). Бинарная последовательность для растений была введена в штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101, а также в листья Nicotiana benthamiana методом инфильтрации Agrobacterium и в Arabidopsis thaliana Col-0 методом погружения цветков, соответственно. pUBQ10::qmRGA, pUBQ10::GID1a-mCherry и pCLV3::mCherry-NLS qmRGA были выделены из потомства F3 и F1 соответствующих скрещиваний, соответственно.
Гибридизация РНК in situ проводилась на верхушках побегов длиной приблизительно 1 см72, которые собирали и немедленно фиксировали в растворе FAA (3,7% формальдегида, 5% уксусной кислоты, 50% этанола), предварительно охлажденном до 4 °C. После двух обработок вакуумом по 15 минут фиксатор меняли, и образцы инкубировали в течение ночи. КДНК GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 и RGL3, а также антисмысловые зонды к их 3'-нетранслируемым областям были синтезированы с использованием праймеров, указанных в дополнительной таблице 3, как описано Розье и др.73. Зонды, меченные дигоксигенином, были обнаружены иммунодетектором с использованием антител к дигоксигенину (разведение в 3000 раз; Roche, каталожный номер: 11 093 274 910), а срезы были окрашены раствором 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфата (BCIP, разведение в 250 раз)/нитросинего тетразолия (NBT, разведение в 200 раз).
Дата публикации: 10 февраля 2025 г.