Белки DELLA консервативнырегуляторы ростакоторые играют центральную роль в развитии растений в ответ на внутренние и внешние сигналы. Будучи регуляторами транскрипции, DELLA связываются с факторами транскрипции (ТФ) и гистоном H2A через свои GRAS-домены и привлекаются для воздействия на промоторы. Недавние исследования показали, что стабильность DELLA регулируется посттрансляционно двумя механизмами: полиубиквитинированием, индуцированным фитогормоном.гиббереллин, что приводит к их быстрой деградации, и конъюгации с малым убиквитин-подобным модификатором (SUMO), что увеличивает их накопление. Более того, активность DELLA динамически регулируется двумя различными механизмами гликозилирования: O-фукозилирование усиливает взаимодействие DELLA-TF, тогда как модификация O-связанного N-ацетилглюкозамина (O-GlcNAc) ингибирует взаимодействие DELLA-TF. Однако роль фосфорилирования DELLA неясна, поскольку предыдущие исследования показали противоречивые результаты: некоторые предполагают, что фосфорилирование способствует или подавляет деградацию DELLA, а другие предполагают, что фосфорилирование не влияет на их стабильность. В настоящей работе мы идентифицируем сайты фосфорилирования в репрессоре GA1-3 (RGA), AtDELLA, очищенном из Arabidopsis thaliana с помощью масс-спектрометрии, и показываем, что фосфорилирование двух пептидов RGA в областях PolyS и PolyS/T усиливает активность RGA, способствуя связыванию H2A и ассоциации RGA с целевыми промоторами. Примечательно, что фосфорилирование не повлияло на взаимодействие RGA-TF или стабильность RGA. Наше исследование раскрывает молекулярный механизм, посредством которого фосфорилирование индуцирует активность DELLA.
Наш масс-спектрометрический анализ показал, что как Pep1, так и Pep2 были сильно фосфорилированы в RGA на фоне дефицита GA Ga1. В дополнение к этому исследованию, фосфопротеомные исследования также выявили фосфорилирование Pep1 в RGA, хотя его роль до сих пор не была изучена53,54,55. Напротив, фосфорилирование Pep2 ранее не было описано, поскольку этот пептид мог быть обнаружен только с помощью трансгена RGAGKG. Хотя мутация m1A, которая отменила фосфорилирование Pep1, лишь немного снизила активность RGA in planta, в сочетании с m2A она имела аддитивный эффект в снижении активности RGA (Дополнительный рисунок 6). Важно, что фосфорилирование Pep1 было значительно снижено в мутанте sly1 с усилением GA по сравнению с ga1, что позволяет предположить, что GA способствует дефосфорилированию RGA, снижая его активность. Механизм, посредством которого GA подавляет фосфорилирование RGA, требует дальнейшего изучения. Одна из возможностей заключается в том, что это достигается посредством регуляции неидентифицированной протеинкиназы. Хотя исследования показали, что экспрессия протеинкиназы CK1 EL1 подавляется ГА в рисе41, наши результаты указывают на то, что мутации более высокого порядка гомолога EL1 Arabidopsis (AEL1-4) не снижают фосфорилирование RGA. В соответствии с нашими результатами, недавнее фосфопротеомное исследование с использованием линий Arabidopsis со сверхэкспрессией AEL и тройного мутанта ael не выявило никаких белков DELLA в качестве субстратов этих киназ56. При подготовке рукописи сообщалось, что GSK3, ген, кодирующий GSK3/SHAGGY-подобную киназу в пшенице (Triticum aestivum), может фосфорилировать DELLA (Rht-B1b)57, хотя фосфорилирование Rht-B1b GSK3 не было подтверждено in planta. Ферментативные реакции in vitro в присутствии GSK3 с последующим масс-спектрометрическим анализом выявили три участка фосфорилирования, расположенных между доменами DELLA и GRAS Rht-B1b (Дополнительный рис. 3). Замены серина на аланин во всех трёх участках фосфорилирования привели к снижению активности Rht-B1b в трансгенной пшенице, что согласуется с нашими выводами о том, что замены аланина в Pep2 RGA снижают активность RGA. Однако анализы деградации белка in vitro также продемонстрировали, что фосфорилирование может также стабилизировать Rht-B1b57. Это противоречит нашим результатам, показывающим, что замены аланина в Pep2 RGA не влияют на его стабильность in planta. GSK3 в пшенице является ортологом нечувствительного к брассиностероидам белка 2 (BIN2) в Arabidopsis 57. BIN2 является негативным регулятором сигнализации BR, а BR активирует его сигнальный путь, вызывая деградацию BIN2 58. Мы показали, что обработка BR не снижает стабильность RGA 59 или уровни фосфорилирования в Arabidopsis (дополнительный рисунок 2), что позволяет предположить, что RGA вряд ли фосфорилируется BIN2.
Все количественные данные были статистически проанализированы с помощью Excel, а значимые различия определялись с помощью t-критерия Стьюдента. Статистические методы для предварительного определения размера выборки не применялись. Данные не исключались из анализа; эксперимент не был рандомизирован; исследователи были осведомлены о распределении во время эксперимента и оценки результатов. Размеры выборок указаны в подписях к рисункам и в файлах с исходными данными.
Время публикации: 15 апреля 2025 г.