Белки DELLA являются консервативными.регуляторы ростаБелки DELLA играют центральную роль в развитии растений в ответ на внутренние и внешние сигналы. В качестве транскрипционных регуляторов, белки DELLA связываются с факторами транскрипции (ТФ) и гистоном H2A через свои GRAS-домены и привлекаются к действию на промоторы. Недавние исследования показали, что стабильность белков DELLA регулируется посттрансляционно двумя механизмами: полиубиквитинированием, индуцированным растительным гормоном.гиббереллинЭто приводит к их быстрой деградации и конъюгации с малым убиквитиноподобным модификатором (SUMO), что увеличивает их накопление. Более того, активность DELLA динамически регулируется двумя различными механизмами гликозилирования: O-фукозилирование усиливает взаимодействие DELLA-TF, тогда как O-связанная модификация N-ацетилглюкозамина (O-GlcNAc) ингибирует взаимодействие DELLA-TF. Однако роль фосфорилирования DELLA остается неясной, поскольку предыдущие исследования показали противоречивые результаты: одни предполагают, что фосфорилирование способствует или подавляет деградацию DELLA, а другие — что фосфорилирование не влияет на их стабильность. Здесь мы идентифицируем сайты фосфорилирования в репрессоре GA1-3 (RGA), AtDELLA, очищенном из Arabidopsis thaliana с помощью масс-спектрометрии, и показываем, что фосфорилирование двух пептидов RGA в областях PolyS и PolyS/T усиливает активность RGA, способствуя связыванию H2A и ассоциации RGA с целевыми промоторами. Примечательно, что фосфорилирование не влияло на взаимодействие RGA-TF или стабильность RGA. Наше исследование выявляет молекулярный механизм, посредством которого фосфорилирование индуцирует активность DELLA.
Наш масс-спектрометрический анализ показал, что как Pep1, так и Pep2 были сильно фосфорилированы в RGA в дефицитном по GA штамме Ga1. В дополнение к этому исследованию, фосфопротеомные исследования также выявили фосфорилирование Pep1 в RGA, хотя его роль еще не изучена53,54,55. В отличие от этого, фосфорилирование Pep2 ранее не описывалось, поскольку этот пептид можно было обнаружить только с помощью трансгена RGAGKG. Хотя мутация m1A, которая подавляла фосфорилирование Pep1, лишь незначительно снижала активность RGA в растении, она оказывала аддитивный эффект при сочетании с m2A в снижении активности RGA (дополнительный рисунок 6). Важно отметить, что фосфорилирование Pep1 было значительно снижено в мутанте sly1 с повышенной активностью GA по сравнению с ga1, что предполагает, что GA способствует дефосфорилированию RGA, снижая его активность. Механизм, посредством которого GA подавляет фосфорилирование RGA, требует дальнейшего исследования. Одна из возможных причин заключается в том, что это достигается за счет регуляции неустановленной протеинкиназы. Хотя исследования показали, что экспрессия протеинкиназы CK1 EL1 подавляется ГА у риса41, наши результаты указывают на то, что мутации более высокого порядка гомолога EL1 у Arabidopsis (AEL1-4) не снижают фосфорилирование RGA. В соответствии с нашими результатами, недавнее фосфопротеомное исследование с использованием линий Arabidopsis с гиперэкспрессией AEL и тройного мутанта ael не выявило каких-либо белков DELLA в качестве субстратов этих киназ56. Когда мы готовили рукопись, сообщалось, что GSK3, ген, кодирующий киназу типа GSK3/SHAGGY у пшеницы (Triticum aestivum), может фосфорилировать DELLA (Rht-B1b)57, хотя фосфорилирование Rht-B1b с помощью GSK3 не было подтверждено в растениях. Ферментативные реакции in vitro в присутствии GSK3 с последующим масс-спектрометрическим анализом выявили три сайта фосфорилирования, расположенные между доменами DELLA и GRAS белка Rht-B1b (дополнительный рисунок 3). Замена серина на аланин во всех трех сайтах фосфорилирования привела к снижению активности Rht-B1b в трансгенной пшенице, что согласуется с нашими данными о том, что замена аланина в Pep2 RGA снижает активность RGA. Однако анализы in vitro деградации белка дополнительно продемонстрировали, что фосфорилирование также может стабилизировать Rht-B1b57. Это противоречит нашим результатам, показывающим, что замена аланина в Pep2 RGA не изменяет его стабильность в растении. GSK3 у пшеницы является ортологом брассиностероид-нечувствительного белка 2 (BIN2) у арабидопсиса 57. BIN2 является негативным регулятором BR-сигнализации, и BR активирует его сигнальный путь, вызывая деградацию BIN2 58. Мы показали, что обработка BR не снижает стабильность RGA 59 или уровни фосфорилирования у арабидопсиса (дополнительный рисунок 2), что предполагает, что RGA вряд ли фосфорилируется BIN2.
Все количественные данные были статистически проанализированы с помощью Excel, а значимые различия определялись с использованием t-критерия Стьюдента. Для предварительного определения размера выборки статистические методы не использовались. Из анализа не исключались никакие данные; эксперимент не был рандомизированным; исследователи знали о распределении участников по группам во время эксперимента и оценки результатов. Размеры выборки указаны в подписях к рисункам и в исходных файлах данных.
Дата публикации: 15 апреля 2025 г.