Фосфорилирование активирует главный регулятор роста DELLA в Arabidopsis, способствуя ассоциации гистона H2A с хроматином.

DELLA белки являются консервативными мастерамирегуляторы ростакоторые играют центральную роль в контроле развития растений в ответ на внутренние и внешние сигналы. DELLA действует как транскрипционный регулятор и привлекается к целевым промоторам путем связывания с факторами транскрипции (TF) и гистоном H2A через свой домен GRAS. Недавние исследования показали, что стабильность DELLA регулируется посттрансляционно посредством двух механизмов: полиубиквитинирование, вызванное фитогормоном гиббереллином, что приводит к его быстрой деградации, и конъюгация небольших убиквитин-подобных модификаторов (SUMO) для увеличения его накопления. Кроме того, активность DELLA динамически регулируется двумя различными гликозилированиями: взаимодействие DELLA-TF усиливается O-фукозилированием, но ингибируется модификацией O-связанного N-ацетилглюкозамина (O-GlcNAc). Однако роль фосфорилирования DELLA остается неясной, поскольку предыдущие исследования показали противоречивые результаты, начиная от тех, которые показывают, что фосфорилирование способствует или снижает деградацию DELLA, до других, которые показывают, что фосфорилирование не влияет на его стабильность. Здесь мы идентифицируем сайты фосфорилирования в REPRESSORga1-3(RGA, AtDELLA) очищены из Arabidopsis thaliana с помощью масс-спектрометрического анализа и показывают, что фосфорилирование двух пептидов RGA в областях PolyS и PolyS/T способствует связыванию H2A и усилению активности RGA. Ассоциация RGA с целевыми промоторами. Примечательно, что фосфорилирование не влияет на взаимодействия RGA-TF или стабильность RGA. Наше исследование раскрывает молекулярный механизм, посредством которого фосфорилирование индуцирует активность DELLA.
Для выяснения роли фосфорилирования в регуляции функции DELLA крайне важно идентифицировать сайты фосфорилирования DELLA in vivo и провести функциональный анализ в растениях. С помощью аффинной очистки растительных экстрактов с последующим анализом MS/MS мы идентифицировали несколько фосфосайтов в RGA. В условиях дефицита GA фосфорилирование RHA увеличивается, но фосфорилирование не влияет на его стабильность. Важно отметить, что анализы co-IP и ChIP-qPCR показали, что фосфорилирование в области PolyS/T RGA способствует его взаимодействию с H2A и его ассоциации с целевыми промоторами, раскрывая механизм, посредством которого фосфорилирование индуцирует функцию RGA.
RGA привлекается для целевого хроматина посредством взаимодействия субдомена LHR1 с TF, а затем связывается с H2A через его область PolyS/T и субдомен PFYRE, образуя комплекс H2A-RGA-TF для стабилизации RGA. Фосфорилирование Pep 2 в области PolyS/T между доменом DELLA и доменом GRAS неопознанной киназой усиливает связывание RGA-H2A. Мутантный белок rgam2A отменяет фосфорилирование RGA и принимает другую конформацию белка, чтобы помешать связыванию H2A. Это приводит к дестабилизации временных взаимодействий TF-rgam2A и диссоциации rgam2A от целевого хроматина. На этом рисунке изображена только транскрипционная репрессия, опосредованная RGA. Подобную картину можно было бы описать для транскрипционной активации, опосредованной RGA, за исключением того, что комплекс H2A-RGA-TF будет способствовать транскрипции целевого гена, а дефосфорилирование rgam2A будет снижать транскрипцию. Рисунок модифицирован из Huang et al.21.
Все количественные данные были статистически проанализированы с помощью Excel, а значимые различия были определены с помощью t-критерия Стьюдента. Для предварительного определения размера выборки статистические методы не использовались. Никакие данные не были исключены из анализа; эксперимент не был рандомизирован; исследователи не были слепы к распределению данных в ходе эксперимента и оценке результатов. Размер выборки указан в легенде рисунка и в файле исходных данных.
Более подробную информацию о дизайне исследования можно найти в аннотации отчета Natural Portfolio, приложенной к этой статье.
Данные масс-спектрометрической протеомики были предоставлены консорциуму ProteomeXchange через партнерский репозиторий PRIDE66 с идентификатором набора данных PXD046004. Все остальные данные, полученные в ходе этого исследования, представлены в разделах «Дополнительная информация», «Дополнительные файлы данных» и «Файлы необработанных данных». Исходные данные предоставлены для этой статьи.