Фосфорилирование активирует главный регулятор роста DELLA у Arabidopsis, способствуя связыванию гистона H2A с хроматином.

Белки DELLA являются консервативными основными белками.регуляторы ростаБелок DELLA играет центральную роль в контроле развития растений в ответ на внутренние и внешние сигналы. DELLA действует как регулятор транскрипции и рекрутируется к целевым промоторам путем связывания с факторами транскрипции (ТФ) и гистоном H2A через свой GRAS-домен. Недавние исследования показали, что стабильность DELLA регулируется посттрансляционно двумя механизмами: полиубиквитинированием, индуцированным фитогормоном гиббереллином, что приводит к его быстрой деградации, и конъюгацией малых убиквитиноподобных модификаторов (SUMO) для увеличения его накопления. Кроме того, активность DELLA динамически регулируется двумя различными гликозилированиями: взаимодействие DELLA-ТФ усиливается O-фукозилированием, но ингибируется O-связанной модификацией N-ацетилглюкозамина (O-GlcNAc). Однако роль фосфорилирования DELLA остается неясной, поскольку предыдущие исследования показали противоречивые результаты: от исследований, демонстрирующих, что фосфорилирование способствует или снижает деградацию DELLA, до исследований, показывающих, что фосфорилирование не влияет на его стабильность. В данном исследовании мы идентифицируем сайты фосфорилирования в REPRESSOR.ga1-3(RGA, AtDELLA), очищенный из Arabidopsis thaliana с помощью масс-спектрометрического анализа, показывает, что фосфорилирование двух пептидов RGA в областях PolyS и PolyS/T способствует связыванию H2A и повышает активность RGA. Ассоциация RGA с целевыми промоторами. Примечательно, что фосфорилирование не влияет на взаимодействие RGA-TF или стабильность RGA. Наше исследование раскрывает молекулярный механизм, посредством которого фосфорилирование индуцирует активность DELLA.
Для выяснения роли фосфорилирования в регуляции функции DELLA крайне важно идентифицировать сайты фосфорилирования DELLA in vivo и провести функциональный анализ в растениях. Путем аффинной очистки растительных экстрактов с последующим MS/MS-анализом мы идентифицировали несколько сайтов фосфорилирования в RGA. В условиях дефицита GA фосфорилирование RHA увеличивается, но фосфорилирование не влияет на его стабильность. Важно отметить, что коиммунопреципитация и ChIP-qPCR показали, что фосфорилирование в области PolyS/T RGA способствует его взаимодействию с H2A и его связыванию с целевыми промоторами, раскрывая механизм, посредством которого фосфорилирование индуцирует функцию RGA.
Белок RGA рекрутируется к целевому хроматину посредством взаимодействия субдомена LHR1 с TF, а затем связывается с H2A через его область PolyS/T и субдомен PFYRE, образуя комплекс H2A-RGA-TF, стабилизирующий RGA. Фосфорилирование Pep 2 в области PolyS/T между доменом DELLA и доменом GRAS неизвестной киназой усиливает связывание RGA-H2A. Мутантный белок rgam2A подавляет фосфорилирование RGA и принимает другую белковую конформацию, препятствуя связыванию H2A. Это приводит к дестабилизации временных взаимодействий TF-rgam2A и диссоциации rgam2A от целевого хроматина. На этом рисунке показано только опосредованное RGA подавление транскрипции. Аналогичная закономерность может быть описана и для опосредованной RGA активации транскрипции, за исключением того, что комплекс H2A-RGA-TF будет способствовать транскрипции целевого гена, а дефосфорилирование rgam2A будет снижать транскрипцию. Рисунок изменен по данным Huang et al.21.
Все количественные данные были статистически проанализированы с помощью Excel, а значимые различия определялись с использованием t-критерия Стьюдента. Для предварительного определения размера выборки статистические методы не использовались. Из анализа не исключались никакие данные; эксперимент не был рандомизированным; исследователи не были осведомлены о распределении данных во время эксперимента и оценке результатов. Размер выборки указан в подписи к рисунку и в исходном файле данных.
Более подробную информацию о методологии исследования см. в аннотации к отчету Natural Portfolio Report Abstract, прилагаемому к данной статье.
Данные протеомики, полученные методом масс-спектрометрии, были предоставлены консорциуму ProteomeXchange через партнерский репозиторий PRIDE66 с идентификатором набора данных PXD046004. Все остальные данные, полученные в ходе этого исследования, представлены в дополнительных материалах, дополнительных файлах данных и файлах исходных данных. Исходные данные для этой статьи предоставлены.