DELLA-белки являются консервативными мастер-белкамирегуляторы ростакоторые играют центральную роль в контроле развития растений в ответ на внутренние и внешние сигналы. DELLA действует как регулятор транскрипции и привлекается к целевым промоторам путем связывания с факторами транскрипции (TF) и гистоном H2A через свой домен GRAS. Недавние исследования показали, что стабильность DELLA посттрансляционно регулируется двумя механизмами: полиубиквитинированием, вызываемым фитогормоном гиббереллином, что приводит к его быстрой деградации, и конъюгацией с малыми убиквитин-подобными модификаторами (SUMO) для увеличения его накопления. Кроме того, активность DELLA динамически регулируется двумя различными гликозилированиями: взаимодействие DELLA-TF усиливается O-фукозилированием, но ингибируется модификацией O-связанного N-ацетилглюкозамина (O-GlcNAc). Однако роль фосфорилирования DELLA остаётся неясной, поскольку предыдущие исследования дали противоречивые результаты: от одних, показывающих, что фосфорилирование способствует или замедляет деградацию DELLA, до других, показывающих, что фосфорилирование не влияет на его стабильность. В данной работе мы идентифицируем сайты фосфорилирования в репрессоре.ga1-3(RGA, AtDELLA), выделенные из Arabidopsis thaliana методом масс-спектрометрического анализа, показали, что фосфорилирование двух пептидов RGA в областях PolyS и PolyS/T способствует связыванию H2A и повышению активности RGA. Ассоциация RGA с целевыми промоторами. Примечательно, что фосфорилирование не влияет на взаимодействие RGA-TF или стабильность RGA. Наше исследование раскрывает молекулярный механизм, посредством которого фосфорилирование индуцирует активность DELLA.
Для выяснения роли фосфорилирования в регуляции функции DELLA крайне важно идентифицировать сайты фосфорилирования DELLA in vivo и провести функциональный анализ растений. С помощью аффинной очистки растительных экстрактов с последующим МС/МС-анализом мы идентифицировали несколько фосфорилированных участков в RGA. В условиях дефицита ГА фосфорилирование RHA усиливается, но не влияет на его стабильность. Важно отметить, что анализы co-IP и ChIP-qPCR показали, что фосфорилирование в области PolyS/T RGA способствует его взаимодействию с H2A и ассоциации с целевыми промоторами, раскрывая механизм, посредством которого фосфорилирование индуцирует функцию RGA.
RGA привлекается к целевому хроматину посредством взаимодействия субдомена LHR1 с TF, а затем связывается с H2A через его область PolyS/T и субдомен PFYRE, образуя комплекс H2A-RGA-TF, стабилизирующий RGA. Фосфорилирование Pep 2 в области PolyS/T между доменами DELLA и GRAS неопознанной киназой усиливает связывание RGA с H2A. Мутантный белок rgam2A блокирует фосфорилирование RGA и принимает другую конформацию белка, препятствуя связыванию H2A. Это приводит к дестабилизации временных взаимодействий TF-rgam2A и диссоциации rgam2A от целевого хроматина. На этом рисунке представлена только репрессия транскрипции, опосредованная RGA. Аналогичную картину можно было бы описать для активации транскрипции, опосредованной RGA, за исключением того, что комплекс H2A-RGA-TF будет способствовать транскрипции целевого гена, а дефосфорилирование rgam2A будет снижать транскрипцию. Рисунок модифицирован из работы Хуанга и соавторов [21].
Все количественные данные были статистически проанализированы с помощью Excel, а значимые различия определялись с помощью t-критерия Стьюдента. Для предварительного определения размера выборки статистические методы не применялись. Данные не исключались из анализа; эксперимент не был рандомизирован; исследователи контролировали распределение данных в ходе эксперимента и оценку результатов. Размер выборки указан в подписи к рисунку и в файле исходных данных.
Более подробную информацию о дизайне исследования можно найти в аннотации отчета Natural Portfolio, приложенной к данной статье.
Данные масс-спектрометрической протеомики были предоставлены консорциуму ProteomeXchange через партнёрский репозиторий PRIDE66 с идентификатором набора данных PXD046004. Все остальные данные, полученные в ходе данного исследования, представлены в разделах «Дополнительная информация», «Файлы дополнительных данных» и «Файлы исходных данных». Исходные данные предоставлены для данной статьи.
Время публикации: 08 ноября 2024 г.