В этом исследовании оценивалась летальность, сублетальность и токсичность коммерческихциперметринформулировки для головастиков бесхвостых амфибий. В остром тесте концентрации 100–800 мкг/л тестировались в течение 96 ч. В хроническом тесте концентрации циперметрина естественного происхождения (1, 3, 6 и 20 мкг/л) тестировались на смертность, после чего проводилось микроядерное тестирование и ядерные аномалии эритроцитов в течение 7 дней. LC50 коммерческой формулы циперметрина для головастиков составляла 273,41 мкг л−1. В хроническом тесте самая высокая концентрация (20 мкг л−1) привела к более чем 50% смертности, поскольку она убила половину протестированных головастиков. Микроядерный тест показал значительные результаты при 6 и 20 мкг л−1, и было обнаружено несколько ядерных аномалий, что указывает на то, что коммерческая формулировка циперметрина имеет генотоксический потенциал против P. gracilis. Циперметрин представляет высокий риск для этого вида, указывая на то, что он может вызвать множество проблем и повлиять на динамику этой экосистемы в краткосрочной и долгосрочной перспективе. Таким образом, можно сделать вывод, что коммерческие формулы циперметрина оказывают токсическое воздействие на P. gracilis.
В связи с постоянным расширением сельскохозяйственной деятельности и интенсивным применениемборьба с вредителямимеры, водные животные часто подвергаются воздействию пестицидов1,2. Загрязнение водных ресурсов вблизи сельскохозяйственных полей может повлиять на развитие и выживание нецелевых организмов, таких как земноводные.
Амфибии становятся все более важными в оценке экологических матриц. Бесхвостые амфибии считаются хорошими биоиндикаторами загрязнителей окружающей среды из-за их уникальных характеристик, таких как сложные жизненные циклы, быстрые темпы роста личинок, трофический статус, проницаемая кожа10,11, зависимость от воды для размножения12 и незащищенные яйца11,13,14. Было показано, что малая водяная лягушка (Physalaemus gracilis), широко известная как плакучая лягушка, является видом-биоиндикатором загрязнения пестицидами4,5,6,7,15. Вид встречается в стоячих водах, на охраняемых территориях или в районах с изменчивой средой обитания в Аргентине, Уругвае, Парагвае и Бразилии1617 и считается стабильным по классификации МСОП из-за своего широкого распространения и толерантности к различным средам обитания18.
У амфибий были зарегистрированы сублетальные эффекты после воздействия циперметрина, включая поведенческие, морфологические и биохимические изменения у головастиков23,24,25, изменение смертности и времени метаморфоза, ферментативные изменения, снижение успешности вылупления24,25, гиперактивность26, ингибирование активности холинэстеразы27 и изменения в показателях плавания7,28. Однако исследования генотоксических эффектов циперметрина у амфибий ограничены. Поэтому важно оценить восприимчивость видов бесхвостых амфибий к циперметрину.
Загрязнение окружающей среды влияет на нормальный рост и развитие амфибий, но наиболее серьезным неблагоприятным эффектом является генетическое повреждение ДНК, вызванное воздействием пестицидов13. Анализ морфологии клеток крови является важным биоиндикатором загрязнения и потенциальной токсичности вещества для диких видов29. Микроядерный тест является одним из наиболее часто используемых методов определения генотоксичности химических веществ в окружающей среде30. Это быстрый, эффективный и недорогой метод, который является хорошим индикатором химического загрязнения организмов, таких как амфибии31,32, и может предоставить информацию о воздействии генотоксичных загрязняющих веществ33.
Целью данного исследования была оценка токсического потенциала коммерческих составов циперметрина для мелких водных головастиков с использованием микроядерного теста и оценки экологического риска.
Кумулятивная смертность (%) головастиков P. gracilis, подвергшихся воздействию различных концентраций коммерческого циперметрина в острый период теста.
Кумулятивная смертность (%) головастиков P. gracilis, подвергшихся воздействию различных концентраций коммерческого циперметрина во время хронического теста.
Наблюдаемая высокая смертность была результатом генотоксических эффектов у амфибий, подвергшихся воздействию различных концентраций циперметрина (6 и 20 мкг/л), о чем свидетельствует наличие микроядер (МЯ) и ядерных аномалий в эритроцитах. Образование МЯ указывает на ошибки в митозе и связано с плохим связыванием хромосом с микротрубочками, дефектами в белковых комплексах, ответственных за захват и транспорт хромосом, ошибками в сегрегации хромосом и ошибками в восстановлении повреждений ДНК38,39 и может быть связано с окислительным стрессом, вызванным пестицидами40,41. Другие аномалии наблюдались при всех оцененных концентрациях. Увеличение концентраций циперметрина увеличивало ядерные аномалии в эритроцитах на 5% и 20% при самой низкой (1 мкг/л) и самой высокой (20 мкг/л) дозах соответственно. Например, изменения в ДНК вида могут иметь серьезные последствия как для краткосрочного, так и для долгосрочного выживания, приводя к сокращению популяции, изменению репродуктивной приспособленности, инбридингу, потере генетического разнообразия и изменению скорости миграции. Все эти факторы могут влиять на выживание и поддержание вида42,43. Образование эритроидных аномалий может указывать на блок цитокинеза, что приводит к аномальному делению клеток (двуядерные эритроциты)44,45; многодольчатые ядра представляют собой выпячивания ядерной мембраны с несколькими долями46, в то время как другие эритроидные аномалии могут быть связаны с амплификацией ДНК, например, ядерные почки/пузырьки47. Наличие безъядерных эритроцитов может указывать на нарушение транспорта кислорода, особенно в загрязненной воде48,49. Апоптоз указывает на гибель клеток50.
Другие исследования также продемонстрировали генотоксические эффекты циперметрина. Кабанья и др.51 продемонстрировали наличие микроядер и ядерных изменений, таких как двуядерные клетки и апоптотические клетки в клетках Odontophrynus americanus после воздействия высоких концентраций циперметрина (5000 и 10 000 мкг л−1) в течение 96 ч. Апоптоз, вызванный циперметрином, также был обнаружен у P. biligonigerus52 и Rhinella arenarum53. Эти результаты свидетельствуют о том, что циперметрин оказывает генотоксическое действие на ряд водных организмов и что анализ MN и ENA может быть индикатором сублетальных эффектов на амфибий и может быть применим к местным видам и диким популяциям, подвергшимся воздействию токсикантов12.
Коммерческие формулы циперметрина представляют высокую опасность для окружающей среды (как острую, так и хроническую), при этом HQ превышают уровень Агентства по охране окружающей среды США (EPA)54, что может неблагоприятно повлиять на вид, если присутствует в окружающей среде. При оценке хронического риска NOEC для смертности составил 3 мкг л−1, что подтверждает, что концентрации, обнаруженные в воде, могут представлять риск для вида55. Летальная NOEC для личинок R. arenarum, подвергшихся воздействию смеси эндосульфана и циперметрина, составила 500 мкг л−1 через 168 ч; это значение снизилось до 0,0005 мкг л−1 через 336 ч. Авторы показывают, что чем дольше воздействие, тем ниже концентрации, вредные для вида. Также важно подчеркнуть, что значения NOEC были выше, чем у P. gracilis при том же времени воздействия, что указывает на то, что реакция вида на циперметрин является видоспецифичной. Кроме того, с точки зрения смертности значение CHQ P. gracilis после воздействия циперметрина достигло 64,67, что выше контрольного значения, установленного Агентством по охране окружающей среды США54, а значение CHQ личинок R. arenarum также было выше этого значения (CHQ > 388,00 через 336 ч), что указывает на то, что исследуемые инсектициды представляют высокий риск для нескольких видов амфибий. Учитывая, что P. gracilis требуется приблизительно 30 дней для завершения метаморфоза56, можно сделать вывод, что исследуемые концентрации циперметрина могут способствовать сокращению популяции, предотвращая переход инфицированных особей во взрослую или репродуктивную стадию в раннем возрасте.
При расчетной оценке риска микроядер и других аномалий ядер эритроцитов значения CHQ варьировались от 14,92 до 97,00, что указывает на то, что циперметрин имел потенциальный генотоксический риск для P. gracilis даже в его естественной среде обитания. Принимая во внимание смертность, максимальная концентрация ксенобиотических соединений, переносимая P. gracilis, составила 4,24 мкг л−1. Однако концентрации вплоть до 1 мкг/л также показали генотоксические эффекты. Этот факт может привести к увеличению числа аномальных особей57 и повлиять на развитие и воспроизводство видов в их среде обитания, что приведет к сокращению популяций амфибий.
Коммерческие формулы инсектицида циперметрина показали высокую острую и хроническую токсичность для P. gracilis. Наблюдались более высокие показатели смертности, вероятно, из-за токсических эффектов, о чем свидетельствует наличие микроядер и ядерных аномалий эритроцитов, особенно зазубренных ядер, дольчатых ядер и везикулярных ядер. Кроме того, изученные виды показали повышенные экологические риски, как острые, так и хронические. Эти данные в сочетании с предыдущими исследованиями нашей исследовательской группы показали, что даже различные коммерческие формулы циперметрина по-прежнему вызывали снижение активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ) и бутирилхолинэстеразы (БХЭ) и окислительный стресс58, а также приводили к изменениям в активности плавания и порокам развития ротовой полости59 у P. gracilis, что указывает на то, что коммерческие формулы циперметрина имеют высокую летальную и сублетальную токсичность для этого вида. Hartmann et al. 60 обнаружили, что коммерческие формулы циперметрина были наиболее токсичны для P. gracilis и другого вида того же рода (P. cuvieri) по сравнению с девятью другими пестицидами. Это говорит о том, что юридически одобренные концентрации циперметрина для защиты окружающей среды могут привести к высокой смертности и долгосрочному сокращению популяции.
Необходимы дальнейшие исследования для оценки токсичности пестицида для амфибий, поскольку концентрации, обнаруженные в окружающей среде, могут вызывать высокую смертность и представлять потенциальный риск для P. gracilis. Исследования видов амфибий следует поощрять, поскольку данные об этих организмах скудны, особенно о бразильских видах.
Тест на хроническую токсичность продолжался 168 ч (7 дней) в статических условиях, а сублетальные концентрации составляли: 1, 3, 6 и 20 мкг а.и. л−1. В обоих экспериментах 10 головастиков на группу обработки оценивались с шестью повторами, в общей сложности 60 головастиков на концентрацию. Между тем, обработка только водой служила в качестве отрицательного контроля. Каждая экспериментальная установка состояла из стерильной стеклянной чашки емкостью 500 мл и плотностью 1 головастик на 50 мл раствора. Колба была покрыта полиэтиленовой пленкой для предотвращения испарения и постоянно аэрировалась.
Вода была подвергнута химическому анализу для определения концентрации пестицидов через 0, 96 и 168 ч. Согласно Сабину и др. 68 и Мартинсу и др. 69 , анализы были выполнены в Лаборатории анализа пестицидов (LARP) Федерального университета Санта-Марии с использованием газовой хроматографии в сочетании с тройной квадрупольной масс-спектрометрией (модель Varian 1200, Пало-Альто, Калифорния, США). Количественное определение пестицидов в воде показано в качестве дополнительного материала (таблица SM1).
Для микроядерного теста (MNT) и теста на ядерную аномалию эритроцитов (RNA) были проанализированы 15 головастиков из каждой группы лечения. Головастиков анестезировали 5% лидокаином (50 мг g-170), а образцы крови собирали путем пункции сердца с помощью одноразовых гепаринизированных шприцев. Мазки крови готовили на стерильных предметных стеклах микроскопа, высушивали на воздухе, фиксировали 100% метанолом (4 °C) в течение 2 минут, а затем окрашивали 10% раствором Гимзы в течение 15 минут в темноте. В конце процесса предметные стекла промывали дистиллированной водой для удаления излишков краски и высушивали при комнатной температуре.
По крайней мере 1000 эритроцитов от каждого головастика были проанализированы с использованием 100-кратного микроскопа с объективом 71 для определения наличия MN и ENA. Всего было оценено 75 796 эритроцитов от головастиков с учетом концентраций циперметрина и контролей. Генотоксичность была проанализирована по методу Карраско и др. и Фенеча и др.38,72 путем определения частоты следующих ядерных поражений: (1) безъядерные клетки: клетки без ядер; (2) апоптотические клетки: фрагментация ядер, запрограммированная гибель клеток; (3) двуядерные клетки: клетки с двумя ядрами; (4) ядерные почки или клетки пузырьков: клетки с ядрами с небольшими выступами ядерной мембраны, пузырьки, похожие по размеру на микроядра; (5) кариолизированные клетки: клетки, имеющие только контур ядра без внутреннего материала; (6) выемчатые клетки: клетки с ядрами с очевидными трещинами или выемками в форме, также называемые почковидными ядрами; (7) дольчатые клетки: клетки с ядерными выступами, большими, чем вышеупомянутые везикулы; и (8) микроклетки: клетки с конденсированными ядрами и редуцированной цитоплазмой. Изменения сравнивали с результатами отрицательного контроля.
Результаты теста на острую токсичность (LC50) анализировались с использованием программного обеспечения GBasic и метода TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Данные хронического теста предварительно проверялись на нормальность ошибок (Шапиро-Уилкс) и однородность дисперсии (Бартлетт). Результаты анализировались с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA). Тест Тьюки использовался для сравнения данных между собой, а тест Даннетта использовался для сравнения данных между группой лечения и группой отрицательного контроля.
Данные LOEC и NOEC были проанализированы с использованием теста Даннетта. Статистические тесты были выполнены с использованием программного обеспечения Statistica 8.0 (StatSoft) с уровнем значимости 95% (p < 0,05).
Время публикации: 13 марта 2025 г.