В этом исследовании оценивалась летальность, сублетальность и токсичность коммерческихциперметринформул для головастиков бесхвостых амфибий. В остром тесте концентрации 100–800 мкг/л тестировались в течение 96 часов. В хроническом тесте природные концентрации циперметрина (1, 3, 6 и 20 мкг/л) тестировались на смертность, после чего проводились микроядерные тесты и ядерные аномалии эритроцитов в течение 7 дней. LC50 коммерческой формулы циперметрина для головастиков составила 273,41 мкг л−1. В хроническом тесте самая высокая концентрация (20 мкг л−1) привела к более чем 50% смертности, поскольку она убила половину протестированных головастиков. Микроядерный тест показал значимые результаты при 6 и 20 мкг л−1, и было обнаружено несколько ядерных аномалий, что указывает на то, что коммерческая формула циперметрина имеет генотоксический потенциал против P. gracilis. Циперметрин представляет высокий риск для этого вида, что указывает на его способность вызывать многочисленные проблемы и влиять на динамику данной экосистемы в краткосрочной и долгосрочной перспективе. Таким образом, можно сделать вывод, что коммерческие препараты циперметрина оказывают токсическое воздействие на P. gracilis.
В связи с постоянным расширением сельскохозяйственной деятельности и интенсивным применениемборьба с вредителямиВ связи с принимаемыми мерами водные животные часто подвергаются воздействию пестицидов1,2. Загрязнение водных ресурсов вблизи сельскохозяйственных полей может повлиять на развитие и выживание нецелевых организмов, таких как земноводные.
Амфибии приобретают всё большую значимость в оценке экологических матриц. Бесхвостые амфибии считаются хорошими биоиндикаторами загрязняющих веществ благодаря своим уникальным характеристикам, таким как сложный жизненный цикл, быстрый рост личинок, трофический статус, проницаемая кожа10,11, зависимость от воды для размножения12 и незащищённость икры11,13,14. Малая водяная лягушка (Physalaemus gracilis), широко известная как плакучая лягушка, является биоиндикатором загрязнения пестицидами4,5,6,7,15. Этот вид встречается в стоячих водоёмах, на охраняемых территориях или в районах с изменчивой средой обитания в Аргентине, Уругвае, Парагвае и Бразилии16,17 и считается стабильным видом по классификации МСОП благодаря широкому распространению и устойчивости к различным средам обитания18.
У амфибий наблюдались сублетальные эффекты после воздействия циперметрина, включая поведенческие, морфологические и биохимические изменения у головастиков23,24,25, изменение смертности и времени метаморфоза, ферментативные изменения, снижение успешности вылупления24,25, гиперактивность26, ингибирование активности холинэстеразы27 и изменения в способности к плаванию7,28. Однако исследования генотоксического действия циперметрина на амфибий ограничены. Поэтому важно оценить восприимчивость бесхвостых амфибий к циперметрину.
Загрязнение окружающей среды влияет на нормальный рост и развитие амфибий, но наиболее серьёзным неблагоприятным эффектом является генетическое повреждение ДНК, вызванное воздействием пестицидов13. Анализ морфологии клеток крови является важным биоиндикатором загрязнения и потенциальной токсичности вещества для диких видов29. Микроядерный тест — один из наиболее распространённых методов определения генотоксичности химических веществ в окружающей среде30. Это быстрый, эффективный и недорогой метод, который служит хорошим индикатором химического загрязнения организмов, таких как амфибии31,32, и может предоставить информацию о воздействии генотоксичных загрязнителей33.
Целью данного исследования была оценка токсического потенциала коммерческих составов циперметрина для мелких водных головастиков с использованием микроядерного теста и оценки экологического риска.
Кумулятивная смертность (%) головастиков P. gracilis, подвергшихся воздействию различных концентраций коммерческого циперметрина в острый период теста.
Кумулятивная смертность (%) головастиков P. gracilis, подвергшихся воздействию различных концентраций коммерческого циперметрина во время хронического теста.
Наблюдаемая высокая смертность была результатом генотоксических эффектов у амфибий, подвергшихся воздействию различных концентраций циперметрина (6 и 20 мкг/л), о чем свидетельствует наличие микроядер (МЯ) и ядерных аномалий в эритроцитах. Образование МЯ указывает на ошибки в митозе и связано с плохим связыванием хромосом с микротрубочками, дефектами в белковых комплексах, ответственных за захват и транспорт хромосом, ошибками в сегрегации хромосом и ошибками в репарации повреждений ДНК38,39 и может быть связано с окислительным стрессом, вызванным пестицидами40,41. Другие аномалии наблюдались при всех оцениваемых концентрациях. Повышение концентрации циперметрина увеличивало ядерные аномалии в эритроцитах на 5% и 20% при самой низкой (1 мкг/л) и самой высокой (20 мкг/л) дозах соответственно. Например, изменения в ДНК вида могут иметь серьёзные последствия как для краткосрочного, так и для долгосрочного выживания, приводя к сокращению популяции, изменению репродуктивной способности, инбридингу, потере генетического разнообразия и изменению темпов миграции. Все эти факторы могут влиять на выживание и поддержание вида42,43. Формирование эритроидных аномалий может указывать на блок цитокинеза, приводящий к аномальному делению клеток (двуядерные эритроциты)44,45; многодольчатые ядра представляют собой выпячивания ядерной мембраны с несколькими долями46, в то время как другие эритроидные аномалии могут быть связаны с амплификацией ДНК, например, ядерные почки/пузырьки47. Наличие безъядерных эритроцитов может указывать на нарушение транспорта кислорода, особенно в загрязнённой воде48,49. Апоптоз свидетельствует о гибели клетки50.
Другие исследования также продемонстрировали генотоксическое действие циперметрина. Кабанья и соавторы51 продемонстрировали наличие микроядер и ядерных изменений, таких как образование двуядерных клеток и апоптотических клеток, в клетках Odontophrynus americanus после воздействия высоких концентраций циперметрина (5000 и 10 000 мкг/л) в течение 96 часов. Апоптоз, вызванный циперметрином, также был обнаружен у P. biligonigerus52 и Rhinella arenarum53. Эти результаты свидетельствуют о том, что циперметрин оказывает генотоксическое действие на ряд водных организмов, и что анализ MN и ENA может служить индикатором сублетального воздействия на амфибий и может быть применим к местным видам и диким популяциям, подвергшимся воздействию токсикантов12.
Коммерческие формулы циперметрина представляют высокую опасность для окружающей среды (как острую, так и хроническую), при этом концентрация HQ превышает уровень, установленный Агентством по охране окружающей среды США (EPA)54, что может негативно повлиять на вид при его присутствии в окружающей среде. При оценке хронического риска NOEC для смертности составила 3 мкг/л, что подтверждает, что концентрации, обнаруженные в воде, могут представлять опасность для вида55. Летальная NOEC для личинок R. arenarum, подвергшихся воздействию смеси эндосульфана и циперметрина, составила 500 мкг/л через 168 ч; это значение снизилось до 0,0005 мкг/л через 336 ч. Авторы показывают, что чем дольше воздействие, тем ниже концентрации, вредные для вида. Также важно подчеркнуть, что значения NOEC были выше, чем у P. gracilis при том же времени воздействия, что указывает на видоспецифичность реакции вида на циперметрин. Кроме того, с точки зрения смертности, значение CHQ P. gracilis после воздействия циперметрина достигло 64,67, что выше референтного значения, установленного Агентством по охране окружающей среды США54, а значение CHQ личинок R. arenarum также было выше этого значения (CHQ > 388,00 через 336 ч), что указывает на то, что исследуемые инсектициды представляют высокий риск для нескольких видов амфибий. Учитывая, что P. gracilis требуется приблизительно 30 дней для завершения метаморфоза56, можно сделать вывод, что исследуемые концентрации циперметрина могут способствовать сокращению популяции, предотвращая переход инфицированных особей во взрослую или репродуктивную стадию в раннем возрасте.
При расчётной оценке риска микроядер и других аномалий ядер эритроцитов значения CHQ варьировались от 14,92 до 97,00, что указывает на потенциальный генотоксический риск циперметрина для P. gracilis даже в естественной среде обитания. С учётом смертности максимальная концентрация ксенобиотических соединений, переносимая P. gracilis, составила 4,24 мкг/л. Однако даже концентрации до 1 мкг/л оказывали генотоксическое действие. Это может приводить к увеличению числа аномальных особей57 и влиять на развитие и воспроизводство видов в местах их обитания, что приводит к сокращению популяций амфибий.
Коммерческие формулы инсектицида циперметрина показали высокую острую и хроническую токсичность для P. gracilis. Наблюдались более высокие показатели смертности, вероятно, из-за токсических эффектов, о чем свидетельствует наличие микроядер и ядерных аномалий эритроцитов, особенно зубчатых ядер, дольчатых ядер и везикулярных ядер. Кроме того, изученные виды показали повышенные экологические риски, как острые, так и хронические. Эти данные, в сочетании с предыдущими исследованиями нашей исследовательской группы, показали, что даже различные коммерческие формулы циперметрина по-прежнему вызывали снижение активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ) и бутирилхолинэстеразы (БХЭ) и окислительный стресс58, и приводили к изменениям активности плавания и порокам развития ротовой полости59 у P. gracilis, что указывает на то, что коммерческие формулы циперметрина обладают высокой летальной и сублетальной токсичностью для этого вида. Hartmann et al. 60 установили, что коммерческие формулы циперметрина оказались наиболее токсичными для P. gracilis и другого вида того же рода (P. cuvieri) по сравнению с девятью другими пестицидами. Это говорит о том, что законодательно разрешенные концентрации циперметрина для защиты окружающей среды могут привести к высокой смертности и долгосрочному сокращению популяции.
Необходимы дальнейшие исследования для оценки токсичности пестицида для амфибий, поскольку концентрации, обнаруженные в окружающей среде, могут вызывать высокую смертность и представлять потенциальный риск для P. gracilis. Следует поощрять исследования видов амфибий, поскольку данные об этих организмах скудны, особенно о бразильских видах.
Тест на хроническую токсичность длился 168 часов (7 дней) в статических условиях, сублетальные концентрации составляли: 1, 3, 6 и 20 мкг активного вещества/л. В обоих экспериментах по 10 головастиков в каждой группе оценивали в шести повторностях, всего 60 головастиков на каждую концентрацию. В качестве отрицательного контроля использовалась только вода. Каждая экспериментальная установка состояла из стерильной стеклянной чашки объёмом 500 мл с плотностью 1 головастик на 50 мл раствора. Колба была накрыта полиэтиленовой плёнкой для предотвращения испарения и постоянно аэрировалась.
Химический анализ воды проводился для определения концентрации пестицидов через 0, 96 и 168 ч. По данным Сабина и др. 68 и Мартинса и др. 69, анализы проводились в Лаборатории анализа пестицидов (LARP) Федерального университета Санта-Марии с использованием газовой хроматографии в сочетании с тройной квадрупольной масс-спектрометрией (модель Varian 1200, Пало-Альто, Калифорния, США). Количественное определение пестицидов в воде представлено в качестве дополнительного материала (таблица SM1).
Для проведения микроядерного теста (МНТ) и теста на ядерные аномалии эритроцитов (РНК) было проанализировано по 15 головастиков из каждой группы. Головастиков анестезировали 5% раствором лидокаина (50 мг g-170), а образцы крови собирали путем пункции сердца одноразовыми гепаринизированными шприцами. Мазки крови готовили на стерильных предметных стеклах, высушивали на воздухе, фиксировали 100% метанолом (4 °C) в течение 2 минут, а затем окрашивали 10% раствором красителя Гимза в течение 15 минут в темноте. По завершении процесса предметные стекла промывали дистиллированной водой для удаления излишков красителя и высушивали при комнатной температуре.
По крайней мере 1000 эритроцитов от каждого головастика были проанализированы с использованием микроскопа 100× с объективом 71 для определения наличия микроядер и ENA. Всего было оценено 75 796 эритроцитов от головастиков с учетом концентраций циперметрина и контролей. Генотоксичность была проанализирована в соответствии с методом Carrasco et al. и Fenech et al.38,72 путем определения частоты следующих ядерных поражений: (1) безъядерные клетки: клетки без ядер; (2) апоптотические клетки: ядерная фрагментация, запрограммированная клеточная смерть; (3) двуядерные клетки: клетки с двумя ядрами; (4) ядерные почки или клетки-пузырьки: клетки с ядрами с небольшими выступами ядерной мембраны, пузырьки, похожие по размеру на микроядра; (5) кариолизированные клетки: клетки, имеющие только контур ядра без внутреннего материала; (6) выемчатые клетки: клетки с ядрами, имеющими выраженные трещины или выемки в форме, также называемые почковидными ядрами; (7) дольчатые клетки: клетки с ядерными выступами, превышающими по размеру вышеупомянутые везикулы; и (8) микроклетки: клетки с уплотненными ядрами и редуцированной цитоплазмой. Изменения сравнивали с результатами отрицательного контроля.
Результаты испытаний на острую токсичность (LC50) анализировались с помощью программного обеспечения GBasic и метода Спирмена-Карбера с усечённой TSK74. Данные хронических испытаний предварительно проверялись на нормальность распределения ошибок (критерий Шапиро-Уилкса) и однородность дисперсии (критерий Бартлетта). Результаты анализировались с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Для сравнения данных между собой использовался критерий Тьюки, а для сравнения данных между группой лечения и группой отрицательного контроля – критерий Даннетта.
Данные LOEC и NOEC анализировались с использованием критерия Даннетта. Статистические тесты проводились с использованием программы Statistica 8.0 (StatSoft) с уровнем значимости 95% (p < 0,05).
Время публикации: 13 марта 2025 г.