В данном исследовании оценивались летальность, сублетальность и токсичность коммерческих препаратов.циперметринПрепараты циперметрина для головастиков амфибий. В остром тесте тестировались концентрации 100–800 мкг/л в течение 96 часов. В хроническом тесте тестировались концентрации природного циперметрина (1, 3, 6 и 20 мкг/л) для оценки смертности, после чего в течение 7 дней проводились микроядерные тесты и анализ ядерных аномалий эритроцитов. LC50 коммерческого препарата циперметрина для головастиков составила 273,41 мкг/л. В хроническом тесте самая высокая концентрация (20 мкг/л) привела к смертности более 50%, так как она убила половину протестированных головастиков. Микроядерные тесты показали значимые результаты при концентрациях 6 и 20 мкг/л, и были обнаружены несколько ядерных аномалий, что указывает на генотоксический потенциал коммерческого препарата циперметрина в отношении P. gracilis. Циперметрин представляет собой высокий риск для этого вида, что указывает на его способность вызывать многочисленные проблемы и влиять на динамику данной экосистемы как в краткосрочной, так и в долгосрочной перспективе. Следовательно, можно сделать вывод, что коммерческие препараты циперметрина оказывают токсическое воздействие на P. gracilis.
В связи с непрерывным расширением сельскохозяйственной деятельности и интенсивным применениемборьба с вредителямиВ результате мер по борьбе с загрязнением окружающей среды водные животные часто подвергаются воздействию пестицидов1,2. Загрязнение водных ресурсов вблизи сельскохозяйственных полей может повлиять на развитие и выживание нецелевых организмов, таких как амфибии.
Земноводные приобретают все большее значение в оценке состояния окружающей среды. Бесхвостые амфибии считаются хорошими биоиндикаторами загрязнителей окружающей среды благодаря своим уникальным характеристикам, таким как сложные жизненные циклы, высокие темпы роста личинок, трофический статус, проницаемая кожа10,11, зависимость от воды для размножения12 и незащищенные яйца11,13,14. Малая водяная лягушка (Physalaemus gracilis), широко известная как плачущая лягушка, была показана как вид-биоиндикатор загрязнения пестицидами4,5,6,7,15. Этот вид встречается в стоячих водоемах, охраняемых территориях или районах с изменчивой средой обитания в Аргентине, Уругвае, Парагвае и Бразилии1617 и считается стабильным согласно классификации МСОП благодаря широкому распространению и толерантности к различным местообитаниям18.
Сообщалось о сублетальных эффектах у амфибий после воздействия циперметрина, включая поведенческие, морфологические и биохимические изменения у головастиков23,24,25, изменение смертности и времени метаморфоза, ферментативные изменения, снижение успешности вылупления24,25, гиперактивность26, ингибирование активности холинэстеразы27 и изменения в плавательных способностях7,28. Однако исследования генотоксического действия циперметрина на амфибий ограничены. Поэтому важно оценить восприимчивость видов бесхвостых амфибий к циперметрину.
Загрязнение окружающей среды влияет на нормальный рост и развитие амфибий, но наиболее серьезным неблагоприятным последствием является генетическое повреждение ДНК, вызванное воздействием пестицидов13. Анализ морфологии клеток крови является важным биоиндикатором загрязнения и потенциальной токсичности вещества для диких видов29. Микроядерный тест — один из наиболее часто используемых методов определения генотоксичности химических веществ в окружающей среде30. Это быстрый, эффективный и недорогой метод, который является хорошим индикатором химического загрязнения организмов, таких как амфибии31,32, и может предоставить информацию о воздействии генотоксичных загрязнителей33.
Целью данного исследования была оценка токсического потенциала коммерческих препаратов циперметрина для мелких водных головастиков с использованием микроядерного теста и оценки экологического риска.
Кумулятивная смертность (%) головастиков P. gracilis, подвергшихся воздействию различных концентраций коммерческого циперметрина в течение острого периода эксперимента.
Кумулятивная смертность (%) головастиков P. gracilis, подвергшихся воздействию различных концентраций коммерческого циперметрина в ходе хронического эксперимента.
Высокая смертность, отмеченная в данном исследовании, была результатом генотоксического воздействия на амфибий, подвергшихся воздействию различных концентраций циперметрина (6 и 20 мкг/л), о чем свидетельствует наличие микроядер (МЯ) и ядерных аномалий в эритроцитах. Образование МЯ указывает на ошибки митоза и связано с плохим связыванием хромосом с микротрубочками, дефектами белковых комплексов, ответственных за поглощение и транспорт хромосом, ошибками в сегрегации хромосом и ошибками в репарации повреждений ДНК38,39, а также может быть связано с окислительным стрессом, вызванным пестицидами40,41. Другие аномалии наблюдались при всех исследованных концентрациях. Увеличение концентрации циперметрина приводило к увеличению ядерных аномалий в эритроцитах на 5% и 20% при самых низких (1 мкг/л) и самых высоких (20 мкг/л) дозах соответственно. Например, изменения в ДНК вида могут иметь серьезные последствия как для краткосрочного, так и для долгосрочного выживания, приводя к сокращению численности популяции, изменению репродуктивной способности, инбридингу, потере генетического разнообразия и изменению скорости миграции. Все эти факторы могут влиять на выживание и поддержание вида42,43. Образование эритроидных аномалий может указывать на блокировку цитокинеза, приводящую к аномальному делению клеток (двуядерные эритроциты)44,45; многодольные ядра представляют собой выступы ядерной мембраны с множеством долей46, в то время как другие эритроидные аномалии могут быть связаны с амплификацией ДНК, например, ядерные почки/пузырьки47. Наличие безъядерных эритроцитов может указывать на нарушение транспорта кислорода, особенно в загрязненной воде48,49. Апоптоз указывает на гибель клетки50.
Другие исследования также продемонстрировали генотоксическое действие циперметрина. Кабанья и др.51 показали наличие микроядер и ядерных изменений, таких как двуядерные клетки и апоптоз, в клетках Odontophrynus americanus после воздействия высоких концентраций циперметрина (5000 и 10 000 мкг/л) в течение 96 часов. Апоптоз, вызванный циперметрином, также был обнаружен у P. biligonigerus52 и Rhinella arenarum53. Эти результаты свидетельствуют о том, что циперметрин оказывает генотоксическое действие на ряд водных организмов и что анализ микроядер и ядерных изменений может быть индикатором сублетальных эффектов на амфибиях и может быть применим к местным видам и диким популяциям, подвергающимся воздействию токсикантов12.
Коммерческие препараты циперметрина представляют собой высокую экологическую опасность (как острую, так и хроническую), при этом концентрации превышают уровень, установленный Агентством по охране окружающей среды США (EPA)54, что может негативно сказаться на видах, если препарат присутствует в окружающей среде. При оценке хронического риска NOEC для смертности составил 3 мкг/л, что подтверждает, что концентрации, обнаруженные в воде, могут представлять опасность для видов55. Летальная концентрация NOEC для личинок R. arenarum, подвергшихся воздействию смеси эндосульфана и циперметрина, составила 500 мкг/л через 168 часов; это значение снизилось до 0,0005 мкг/л через 336 часов. Авторы показывают, что чем дольше воздействие, тем ниже концентрации, вредные для видов. Важно также отметить, что значения NOEC были выше, чем у P. gracilis при том же времени воздействия, что указывает на видоспецифическую реакцию вида на циперметрин. Кроме того, что касается смертности, значение CHQ у P. gracilis после воздействия циперметрина достигло 64,67, что выше эталонного значения, установленного Агентством по охране окружающей среды США⁵⁴, а значение CHQ у личинок R. arenarum также было выше этого значения (CHQ > 388,00 через 336 ч), что указывает на то, что исследуемые инсектициды представляют высокий риск для нескольких видов амфибий. Учитывая, что P. gracilis требуется приблизительно 30 дней для завершения метаморфоза⁵⁶, можно заключить, что исследуемые концентрации циперметрина могут способствовать сокращению популяции, препятствуя переходу зараженных особей во взрослую или репродуктивную стадию в раннем возрасте.
В расчетной оценке риска микроядер и других ядерных аномалий эритроцитов значения CHQ варьировались от 14,92 до 97,00, что указывает на потенциальный генотоксический риск циперметрина для P. gracilis даже в его естественной среде обитания. С учетом смертности, максимальная допустимая концентрация ксенобиотических соединений для P. gracilis составляла 4,24 мкг/л. Однако даже низкие концентрации, например, 1 мкг/л, также демонстрировали генотоксическое действие. Этот факт может привести к увеличению числа аномальных особей57 и повлиять на развитие и размножение вида в его среде обитания, что приведет к сокращению популяций амфибий.
Коммерческие препараты инсектицида циперметрина продемонстрировали высокую острую и хроническую токсичность для P. gracilis. Наблюдались более высокие показатели смертности, вероятно, из-за токсического воздействия, о чем свидетельствует наличие микроядер и аномалий ядер эритроцитов, особенно зазубренных, дольчатых и везикулярных ядер. Кроме того, у исследуемого вида наблюдались повышенные экологические риски, как острые, так и хронические. Эти данные, в сочетании с предыдущими исследованиями нашей исследовательской группы, показали, что даже различные коммерческие препараты циперметрина все же вызывали снижение активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ) и бутирилхолинэстеразы (БХЭ), окислительный стресс58, а также изменения в плавательной активности и деформации ротовой полости59 у P. gracilis, что указывает на высокую летальную и сублетальную токсичность коммерческих препаратов циперметрина для этого вида. Хартманн и др. Исследование 60 показало, что коммерческие препараты циперметрина оказались наиболее токсичными для P. gracilis и другого вида того же рода (P. cuvieri) по сравнению с девятью другими пестицидами. Это позволяет предположить, что разрешенные законом концентрации циперметрина для защиты окружающей среды могут привести к высокой смертности и долгосрочному сокращению численности популяции.
Необходимы дальнейшие исследования для оценки токсичности пестицида для амфибий, поскольку обнаруженные в окружающей среде концентрации могут вызывать высокую смертность и представлять потенциальный риск для P. gracilis. Следует поощрять исследования видов амфибий, поскольку данные об этих организмах скудны, особенно о бразильских видах.
Тест на хроническую токсичность длился 168 часов (7 дней) в статических условиях, а сублетальные концентрации составляли: 1, 3, 6 и 20 мкг действующего вещества/л. В обоих экспериментах оценивали по 10 головастиков на каждую группу обработки с шестью повторениями, всего 60 головастиков на каждую концентрацию. В качестве отрицательного контроля использовали обработку только водой. Каждая экспериментальная установка состояла из стерильной стеклянной чашки объемом 500 мл с плотностью 1 головастик на 50 мл раствора. Чашка была накрыта полиэтиленовой пленкой для предотвращения испарения и постоянно аэрировалась.
Для определения концентрации пестицидов в воде через 0, 96 и 168 часов был проведен химический анализ. Согласно работам Сабина и др. 68 и Мартинса и др. 69, анализы проводились в Лаборатории анализа пестицидов (LARP) Федерального университета Санта-Марии с использованием газовой хроматографии, соединенной с тройным квадрупольным масс-спектрометром (Varian модель 1200, Пало-Альто, Калифорния, США). Количественное определение пестицидов в воде представлено в дополнительных материалах (таблица SM1).
Для микроядерного теста (МНТ) и теста на аномалии ядер эритроцитов (РНК) анализировали по 15 головастиков из каждой экспериментальной группы. Головастиков анестезировали 5%-ным лидокаином (50 мг/г), а образцы крови отбирали путем пункции сердца с использованием одноразовых шприцев с гепарином. Мазки крови готовили на стерильных предметных стеклах микроскопа, высушивали на воздухе, фиксировали 100%-ным метанолом (4 °C) в течение 2 минут, а затем окрашивали 10%-ным раствором Гимзы в течение 15 минут в темноте. По окончании процесса предметные стекла промывали дистиллированной водой для удаления излишков красителя и высушивали при комнатной температуре.
По меньшей мере 1000 эритроцитов от каждого головастика анализировали с помощью микроскопа с 100-кратным увеличением и объективом 71 для определения наличия микроядер (МН) и эндотелиальных клеток-предшественников (ЭНК). Всего было исследовано 75 796 эритроцитов от головастиков с учетом концентраций циперметрина и контрольных образцов. Генотоксичность анализировали по методу Карраско и др. и Фенека и др.38,72 путем определения частоты следующих ядерных повреждений: (1) безъядерные клетки: клетки без ядер; (2) апоптотические клетки: фрагментация ядра, запрограммированная клеточная смерть; (3) двуядерные клетки: клетки с двумя ядрами; (4) клетки с ядерными почками или пузырьками: клетки с ядрами, имеющими небольшие выступы ядерной мембраны, пузырьки, по размеру похожие на микроядра; (5) кариолизированные клетки: клетки, имеющие только контур ядра без внутреннего материала; (6) клетки с выемками: клетки с ядрами, имеющими явные трещины или выемки, также называемые почкообразными ядрами; (7) дольчатые клетки: клетки с ядерными выступами большего размера, чем вышеупомянутые везикулы; и (8) микроклетки: клетки с конденсированными ядрами и уменьшенной цитоплазмой. Изменения сравнивались с результатами отрицательного контроля.
Результаты тестов на острую токсичность (LC50) анализировались с использованием программного обеспечения GBasic и метода Спирмена-Карбера TSK-Trimmed74. Данные хронических тестов предварительно проверялись на нормальность распределения ошибок (критерий Шапиро-Уилкса) и однородность дисперсии (критерий Бартлетта). Результаты анализировались с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Для сравнения данных между собой использовался критерий Тьюки, а для сравнения данных между экспериментальной группой и группой отрицательного контроля — критерий Даннетта.
Данные LOEC и NOEC анализировались с использованием теста Даннетта. Статистические тесты проводились с помощью программного обеспечения Statistica 8.0 (StatSoft) с уровнем значимости 95% (p < 0,05).
Дата публикации: 13 марта 2025 г.