Широкое использование синтетических пестицидов привело к многочисленным проблемам, включая появление резистентных организмов, ухудшение состояния окружающей среды и вред для здоровья человека. Поэтому новые микробныепестицидыСрочно необходимы безопасные для здоровья человека и окружающей среды биосурфактанты рамнолипида, вырабатываемые Enterobacter cloacae SJ2, в этом исследовании для оценки токсичности для личинок комаров (Culex quinquefasciatus) и термитов (Odontotermes obesus). Результаты показали, что между обработками наблюдался дозозависимый уровень смертности. Значение LC50 (50% летальная концентрация) через 48 часов для биосурфактантов личинок термитов и комаров определялось с использованием метода подгонки кривой нелинейной регрессии. Результаты показали, что 48-часовые значения LC50 (95% доверительный интервал) ларвицидной и антитермитной активности биосурфактанта составили 26,49 мг/л (диапазон от 25,40 до 27,57) и 33,43 мг/л (диапазон от 31,09 до 35,68) соответственно. Согласно гистопатологическому исследованию, обработка биосурфактантами вызвала серьезные повреждения тканей органелл личинок и термитов. Результаты этого исследования показывают, что микробный биосурфактант, продуцируемый Enterobacter cloacae SJ2, является превосходным и потенциально эффективным средством для контроля Cx. quinquefasciatus и O. obesus.
В тропических странах наблюдается большое количество заболеваний, переносимых комарами1. Заболевания, переносимые комарами, широко распространены. Ежегодно от малярии умирает более 400 000 человек, а в некоторых крупных городах наблюдаются эпидемии серьезных заболеваний, таких как лихорадка денге, желтая лихорадка, чикунгунья и вирус Зика2. Трансмиссивные заболевания связаны с одной из шести инфекций в мире, причем комары вызывают наиболее серьезные случаи3,4. Culex, Anopheles и Aedes — три рода комаров, наиболее часто связанных с передачей заболеваний5. Распространенность лихорадки денге, инфекции, переносимой комарами Aedes aegypti, возросла за последнее десятилетие и представляет собой значительную угрозу общественному здравоохранению4,7,8. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), более 40% населения мира подвержены риску лихорадки денге, при этом ежегодно в более чем 100 странах регистрируется 50–100 миллионов новых случаев9,10,11. Лихорадка денге стала серьезной проблемой общественного здравоохранения, поскольку ее заболеваемость возросла во всем мире12,13,14. Anopheles gambiae, широко известный как африканский комар Anopheles, является наиболее важным переносчиком человеческой малярии в тропических и субтропических регионах15. Вирус Западного Нила, энцефалит Сент-Луиса, японский энцефалит и вирусные инфекции лошадей и птиц передаются комарами Culex, которых часто называют обычными домашними комарами. Кроме того, они также являются переносчиками бактериальных и паразитарных заболеваний16. В мире насчитывается более 3000 видов термитов, и они существуют уже более 150 миллионов лет17. Большинство вредителей живут в почве и питаются древесиной и древесными продуктами, содержащими целлюлозу. Индийский термит Odontotermes obesus является серьезным вредителем, который наносит серьезный ущерб важным сельскохозяйственным культурам и плантационным деревьям18. В сельскохозяйственных районах заражение термитами на разных стадиях может нанести огромный экономический ущерб различным сельскохозяйственным культурам, видам деревьев и строительным материалам. Термиты также могут вызывать проблемы со здоровьем у человека19.
Проблема устойчивости микроорганизмов и вредителей в современных фармацевтических и сельскохозяйственных областях является сложной20,21. Поэтому обе компании должны искать новые экономически эффективные противомикробные препараты и безопасные биопестициды. Синтетические пестициды теперь доступны и, как было показано, являются инфекционными и отпугивают нецелевых полезных насекомых22. В последние годы исследования биосурфактантов расширились из-за их применения в различных отраслях промышленности. Биосурфактанты очень полезны и жизненно важны в сельском хозяйстве, рекультивации почв, добыче нефти, удалении бактерий и насекомых и переработке пищевых продуктов23,24. Биосурфактанты или микробные поверхностно-активные вещества являются биосурфактантными химическими веществами, вырабатываемыми микроорганизмами, такими как бактерии, дрожжи и грибки в прибрежных местообитаниях и районах, загрязненных нефтью25,26. Химически полученные поверхностно-активные вещества и биосурфактанты - это два типа, которые получают непосредственно из естественной среды27. Различные биосурфактанты получают из морских местообитаний28,29. Поэтому ученые ищут новые технологии для производства биосурфактантов на основе природных бактерий30,31. Достижения в таких исследованиях демонстрируют важность этих биологических соединений для защиты окружающей среды32. Bacillus, Pseudomonas, Rhodococcus, Alcaligenes, Corynebacterium и эти бактериальные роды являются хорошо изученными представителями23,33.
Существует множество типов биосурфактантов с широким спектром применения34. Значительным преимуществом этих соединений является то, что некоторые из них обладают антибактериальной, ларвицидной и инсектицидной активностью. Это означает, что их можно использовать в сельскохозяйственной, химической, фармацевтической и косметической промышленности35,36,37,38. Поскольку биосурфактанты, как правило, биоразлагаемы и экологически полезны, их используют в комплексных программах борьбы с вредителями для защиты сельскохозяйственных культур39. Таким образом, были получены базовые знания о ларвицидной и антитермитной активности микробных биосурфактантов, продуцируемых Enterobacter cloacae SJ2. Мы исследовали смертность и гистологические изменения при воздействии различных концентраций рамнолипидных биосурфактантов. Кроме того, мы оценили широко используемую компьютерную программу Quantitative Structure-Activity (QSAR) Ecological Structure-Activity (ECOSAR) для определения острой токсичности для микроводорослей, дафний и рыб.
В этом исследовании антитермитная активность (токсичность) очищенных биосурфактантов в различных концентрациях от 30 до 50 мг/мл (с интервалом 5 мг/мл) была протестирована против индийских термитов, O. obesus и четвертого вида )Оценить. Личинки стадии Cx. Личинки комаров quinquefasciatus. Концентрации биосурфактанта LC50 в течение 48 часов против O. obesus и Cx. C. solanacearum. Личинки комаров были идентифицированы с использованием метода подгонки кривой нелинейной регрессии. Результаты показали, что смертность термитов увеличивалась с увеличением концентрации биосурфактанта. Результаты показали, что биосурфактант обладал ларвицидной активностью (рисунок 1) и противотермитной активностью (рисунок 2) с 48-часовыми значениями LC50 (95% ДИ) 26,49 мг/л (25,40–27,57) и 33,43 мг/л (рис. 31,09–35,68) соответственно (таблица 1). С точки зрения острой токсичности (48 часов) биосурфактант классифицируется как «вредный» для тестируемых организмов. Биосурфактант, полученный в этом исследовании, показал превосходную ларвицидную активность со 100% смертностью в течение 24–48 часов после воздействия.
Рассчитайте значение LC50 для ларвицидной активности. Нелинейная регрессионная кривая (сплошная линия) и 95% доверительный интервал (заштрихованная область) для относительной смертности (%).
Рассчитайте значение LC50 для противотермитной активности. Нелинейная регрессионная кривая (сплошная линия) и 95% доверительный интервал (заштрихованная область) для относительной смертности (%).
В конце эксперимента морфологические изменения и аномалии наблюдались под микроскопом. Морфологические изменения наблюдались в контрольной и обработанной группах при 40-кратном увеличении. Как показано на рисунке 3, у большинства личинок, обработанных биосурфактантами, наблюдалось нарушение роста. На рисунке 3а показан нормальный Cx. quinquefasciatus, на рисунке 3б показан аномальный Cx. Вызывает пять личинок нематод.
Влияние сублетальных (LC50) доз биосурфактантов на развитие личинок Culex quinquefasciatus. Изображение светового микроскопа (a) нормального Cx при 40-кратном увеличении. quinquefasciatus (b) Аномальный Cx. Вызывает пять личинок нематод.
В настоящем исследовании гистологическое исследование обработанных личинок (рис. 4) и термитов (рис. 5) выявило несколько аномалий, включая уменьшение площади брюшной полости и повреждение мышц, эпителиальных слоев и кожи. средней кишки. Гистология выявила механизм ингибирующей активности биосурфактанта, использованного в этом исследовании.
Гистопатология нормальных нелеченых личинок Cx 4-й стадии. Личинки quinquefasciatus (контроль: (a,b)) и обработанные биосурфактантом (обработка: (c,d)). Стрелки указывают на обработанный кишечный эпителий (epi), ядра (n) и мышцы (mu). Полоса = 50 мкм.
Гистопатология нормального нелеченого O. obesus (контроль: (a,b)) и обработанного биосурфактантом (лечение: (c,d)). Стрелки указывают на кишечный эпителий (epi) и мышцу (mu) соответственно. Полоса = 50 мкм.
В этом исследовании ECOSAR использовался для прогнозирования острой токсичности продуктов рамнолипидного биосурфактанта для первичных производителей (зеленые водоросли), первичных потребителей (водяные блохи) и вторичных потребителей (рыбы). Эта программа использует сложные количественные модели соединений структура-активность для оценки токсичности на основе молекулярной структуры. Модель использует программное обеспечение структура-активность (SAR) для расчета острой и долгосрочной токсичности веществ для водных видов. В частности, в таблице 2 суммированы предполагаемые средние летальные концентрации (LC50) и средние эффективные концентрации (EC50) для нескольких видов. Предполагаемая токсичность была классифицирована по четырем уровням с использованием Глобально согласованной системы классификации и маркировки химических веществ (таблица 3).
Контроль трансмиссивных заболеваний, особенно штаммов комаров и комаров Aedes. Египтяне, теперь трудная работа40,41,42,43,44,45,46. Хотя некоторые химически доступные пестициды, такие как пиретроиды и органофосфаты, в некоторой степени полезны, они представляют значительный риск для здоровья человека, включая диабет, репродуктивные расстройства, неврологические расстройства, рак и респираторные заболевания. Более того, со временем эти насекомые могут стать устойчивыми к ним13,43,48. Таким образом, эффективные и экологически чистые меры биологического контроля станут более популярным методом контроля комаров49,50. Бенелли51 предположил, что ранний контроль комаров-переносчиков будет более эффективным в городских районах, но они не рекомендовали использовать ларвициды в сельской местности52. Том и др.53 также предположили, что контроль комаров на их незрелых стадиях будет безопасной и простой стратегией, поскольку они более чувствительны к средствам контроля54.
Производство биосурфактанта мощным штаммом (Enterobacter cloacae SJ2) показало постоянную и многообещающую эффективность. В нашем предыдущем исследовании сообщалось, что Enterobacter cloacae SJ2 оптимизирует производство биосурфактанта с использованием физико-химических параметров26. Согласно их исследованию, оптимальными условиями для производства биосурфактанта потенциальным изолятом E. cloacae были инкубация в течение 36 часов, перемешивание при 150 об/мин, pH 7,5, 37 °C, соленость 1 ppt, 2% глюкозы в качестве источника углерода, 1% дрожжей. Экстракт использовался в качестве источника азота для получения 2,61 г/л биосурфактанта. Кроме того, биосурфактанты были охарактеризованы с помощью ТСХ, ИК-Фурье и MALDI-TOF-MS. Это подтвердило, что рамнолипид является биосурфактантом. Гликолипидные биосурфактанты являются наиболее интенсивно изучаемым классом других типов биосурфактантов55. Они состоят из углеводных и липидных частей, в основном цепей жирных кислот. Среди гликолипидов основными представителями являются рамнолипид и софоролипид56. Рамнолипиды содержат два фрагмента рамнозы, связанных с моно- или ди-β-гидроксидекановой кислотой57. Использование рамнолипидов в медицинской и фармацевтической промышленности хорошо известно58, в дополнение к их недавнему использованию в качестве пестицидов59.
Взаимодействие биосурфактанта с гидрофобной областью дыхательного сифона позволяет воде проходить через его устьичную полость, тем самым увеличивая контакт личинок с водной средой. Присутствие биосурфактантов также влияет на трахею, длина которой близка к поверхности, что облегчает личинкам выползание на поверхность и дыхание. В результате поверхностное натяжение воды уменьшается. Поскольку личинки не могут прикрепиться к поверхности воды, они падают на дно резервуара, нарушая гидростатическое давление, что приводит к чрезмерному расходу энергии и гибели от утопления38,60. Аналогичные результаты были получены Ghribi61, где биосурфактант, продуцируемый Bacillus subtilis, проявил ларвицидную активность против Ephestia kuehniella. Аналогично ларвицидная активность Cx. Дас и Мукерджи23 также оценили влияние циклических липопептидов на личинки квинкефасциатуса.
Результаты этого исследования касаются ларвицидной активности рамнолипидных биосурфактантов против Cx. Уничтожение комаров quinquefasciatus согласуется с ранее опубликованными результатами. Например, используются биосурфактанты на основе сурфактина, вырабатываемые различными бактериями рода Bacillus. и Pseudomonas spp. В некоторых ранних отчетах64,65,66 сообщалось об активности липопептидных биосурфактантов из Bacillus subtilis по уничтожению личинок23. Дипали и др.63 обнаружили, что рамнолипидный биосурфактант, выделенный из Stenotropomonas maltophilia, обладал мощной ларвицидной активностью в концентрации 10 мг/л. Сильва и др.67 сообщили о ларвицидной активности рамнолипидного биосурфактанта против Ae в концентрации 1 г/л. Aedes aegypti. Канакданде и др. 68 сообщили, что липопептидные биосурфактанты, произведенные Bacillus subtilis, вызвали общую смертность личинок Culex и термитов с липофильной фракцией Eucalyptus. Аналогично, Masendra et al. 69 сообщили о смертности рабочих муравьев (Cryptotermes cynocephalus Light.) 61,7% в липофильных фракциях n-гексана и EtOAc сырого экстракта E.
Parthipan et al 70 сообщили об инсектицидном использовании липопептидных биосурфактантов, продуцируемых Bacillus subtilis A1 и Pseudomonas stutzeri NA3, против Anopheles Stephensi, переносчика малярийного паразита Plasmodium. Они наблюдали, что личинки и куколки выживали дольше, имели более короткие периоды яйцекладки, были стерильными и имели более короткую продолжительность жизни при обработке различными концентрациями биосурфактантов. Наблюдаемые значения LC50 биосурфактанта B. subtilis A1 составили 3,58, 4,92, 5,37, 7,10 и 7,99 мг/л для различных личиночных состояний (т. е. личинки I, II, III, IV и стадии куколки) соответственно. Для сравнения, биосурфактанты для личиночных стадий I-IV и куколочных стадий Pseudomonas stutzeri NA3 составили 2,61, 3,68, 4,48, 5,55 и 6,99 мг/л соответственно. Считается, что замедленная фенология выживших личинок и куколок является результатом значительных физиологических и метаболических нарушений, вызванных обработкой инсектицидами71.
Штамм Wickerhamomyces anomalus CCMA 0358 производит биосурфактант со 100% ларвицидной активностью против комаров Aedes. aegypti 24-часовой интервал 38 был выше, чем сообщалось Силвой и др. Биосурфактант, полученный из Pseudomonas aeruginosa с использованием подсолнечного масла в качестве источника углерода, как было показано, убивает 100% личинок в течение 48 часов 67 . Абиная и др. 72 и Прадхан и др. 73 также продемонстрировали ларвицидное или инсектицидное действие поверхностно-активных веществ, продуцируемых несколькими изолятами рода Bacillus. Ранее опубликованное исследование Сентила-Натана и др. показало, что 100% личинок комаров, подвергшихся воздействию растительных лагун, вероятно, погибнут. 74.
Оценка сублетальных эффектов инсектицидов на биологию насекомых имеет решающее значение для комплексных программ борьбы с вредителями, поскольку сублетальные дозы/концентрации не убивают насекомых, но могут сократить популяции насекомых в будущих поколениях, нарушая биологические характеристики10. Сикейра и др. 75 наблюдали полную ларвицидную активность (100% смертность) рамнолипидного биосурфактанта (300 мг/мл) при тестировании в различных концентрациях от 50 до 300 мг/мл. Личиночная стадия штаммов Aedes aegypti. Они проанализировали влияние времени до смерти и сублетальных концентраций на выживаемость личинок и плавательную активность. Кроме того, они наблюдали снижение скорости плавания после 24–48 часов воздействия сублетальных концентраций биосурфактанта (например, 50 мг/мл и 100 мг/мл). Яды, которые имеют многообещающие сублетальные роли, считаются более эффективными в нанесении множественного ущерба подвергшимся воздействию вредителям76.
Гистологические наблюдения наших результатов показывают, что биосурфактанты, продуцируемые Enterobacter cloacae SJ2, значительно изменяют ткани личинок комаров (Cx. quinquefasciatus) и термитов (O. obesus). Аналогичные аномалии были вызваны препаратами базиликового масла у An. gambiaes.s и An. arabica, описанными Ochola77. Камарадж и др.78 также описали те же морфологические аномалии у личинок An. Стефани, подвергшихся воздействию наночастиц золота. Васанта-Сринивасан и др.79 также сообщили, что эфирное масло пастушьей сумки серьезно повредило камеру и эпителиальные слои Aedes albopictus. Aedes aegypti. Рагхавендран и др. сообщили, что личинки комаров были обработаны 500 мг/мл мицелиальным экстрактом местного гриба Penicillium. Ae демонстрируют серьезные гистологические повреждения. aegypti и Cx. Коэффициент смертности 80. Ранее, Abinaya et al. Были изучены личинки An четвертой стадии. Stephensi и Ae. aegypti обнаружили многочисленные гистологические изменения у Aedes aegypti, обработанных экзополисахаридами B. licheniformis, включая слепую кишку желудка, атрофию мышц, повреждение и дезорганизацию ганглиев нервного канатика72. По данным Raghavendran et al., после обработки экстрактом мицелия P. daleae клетки средней кишки тестируемых комаров (личинки четвертой стадии) показали отек просвета кишечника, уменьшение межклеточного содержимого и ядерную дегенерацию81. Те же гистологические изменения наблюдались у личинок комаров, обработанных экстрактом листьев эхинацеи, что указывает на инсектицидный потенциал обработанных соединений50.
Использование программного обеспечения ECOSAR получило международное признание82. Текущие исследования показывают, что острая токсичность биосурфактантов ECOSAR для микроводорослей (C. vulgaris), рыб и водяных блох (D. magna) попадает в категорию «токсичности», определенную Организацией Объединенных Наций83. Модель экотоксичности ECOSAR использует SAR и QSAR для прогнозирования острой и долгосрочной токсичности веществ и часто используется для прогнозирования токсичности органических загрязнителей82,84.
Параформальдегид, натрий-фосфатный буфер (рН 7,4) и все другие химические вещества, использованные в этом исследовании, были приобретены в HiMedia Laboratories, Индия.
Производство биосурфактанта осуществлялось в колбах Эрленмейера объемом 500 мл, содержащих 200 мл стерильной среды Бушнелла-Хааса с добавлением 1% сырой нефти в качестве единственного источника углерода. Прекультура Enterobacter cloacae SJ2 (1,4 × 104 КОЕ/мл) была инокулирована и культивирована на орбитальном шейкере при 37°C, 200 об/мин в течение 7 дней. После периода инкубации биосурфактант был извлечен путем центрифугирования культуральной среды при 3400×g в течение 20 минут при 4°C, и полученный супернатант использовался для скрининга. Процедуры оптимизации и характеристика биосурфактантов были заимствованы из нашего более раннего исследования26.
Личинки Culex quinquefasciatus были получены из Центра передовых исследований в области морской биологии (CAS), Палачинпетай, Тамил Наду (Индия). Личинки выращивались в пластиковых контейнерах, заполненных деионизированной водой при температуре 27 ± 2°C и фотопериоде 12:12 (свет:темнота). Личинки комаров питались 10% раствором глюкозы.
Личинки Culex quinquefasciatus были обнаружены в открытых и незащищенных септиках. Используйте стандартные руководства по классификации для идентификации и культивирования личинок в лаборатории85. Испытания ларвицидности проводились в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения86. SH. Личинки четвертой стадии quinquefasciatus были собраны в закрытые пробирки группами по 25 мл и 50 мл с воздушным зазором в две трети их вместимости. Биосурфактант (0–50 мг/мл) добавляли в каждую пробирку по отдельности и хранили при 25 °C. В контрольной пробирке использовалась только дистиллированная вода (50 мл). Мертвыми считались личинки, которые не показывали признаков плавания в течение инкубационного периода (12–48 часов)87. Рассчитайте процент смертности личинок, используя уравнение. (1)88.
Семейство Odontotermitidae включает индийского термита Odontotermes obesus, обнаруженного в гниющих бревнах в Сельскохозяйственном кампусе (Университет Аннамалай, Индия). Испытайте этот биосурфактант (0–50 мг/мл) с использованием обычных процедур, чтобы определить, является ли он вредным. После сушки в ламинарном потоке воздуха в течение 30 минут каждая полоска ватмана была покрыта биосурфактантом в концентрации 30, 40 или 50 мг/мл. Предварительно покрытые и непокрытые полоски бумаги были испытаны и сравнены в центре чашки Петри. Каждая чашка Петри содержит около тридцати активных термитов O. obesus. Контрольным и подопытным термитам давали влажную бумагу в качестве источника пищи. Все чашки содержались при комнатной температуре в течение всего периода инкубации. Термиты погибали через 12, 24, 36 и 48 часов89,90. Затем уравнение 1 использовалось для оценки процента смертности термитов при различных концентрациях биосурфактанта. (2).
Образцы хранились на льду и упаковывались в микропробирки, содержащие 100 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера (pH 7,4), и отправлялись в Центральную лабораторию патологии аквакультуры (CAPL) Центра аквакультуры имени Раджива Ганди (RGCA). Гистологическая лаборатория, Сиркали, округ Майиладутурай, Тамилнад, Индия для дальнейшего анализа. Образцы немедленно фиксировались в 4% параформальдегиде при температуре 37°C в течение 48 часов.
После фазы фиксации материал промывали три раза 0,1 М натрий-фосфатным буфером (pH 7,4), поэтапно дегидратировали в этаноле и замачивали в смоле LEICA в течение 7 дней. Затем вещество помещали в пластиковую форму, заполненную смолой и полимеризатором, а затем помещали в печь, нагретую до 37°C, пока блок, содержащий вещество, полностью не полимеризуется.
После полимеризации блоки разрезали с помощью микротома LEICA RM2235 (Rankin Biomedical Corporation 10,399 Enterprise Dr. Davisburg, MI 48,350, USA) до толщины 3 мм. Срезы группировали на предметных стеклах, по шесть срезов на предметное стекло. Срезы высушивали при комнатной температуре, затем окрашивали гематоксилином в течение 7 мин и промывали проточной водой в течение 4 мин. Кроме того, на кожу наносили раствор эозина на 5 мин и промывали проточной водой в течение 5 мин.
Острая токсичность была предсказана с использованием водных организмов из разных тропических уровней: 96-часовая LC50 для рыб, 48-часовая LC50 для D. magna и 96-часовая EC50 для зеленых водорослей. Токсичность рамнолипидных биосурфактантов для рыб и зеленых водорослей была оценена с использованием программного обеспечения ECOSAR версии 2.2 для Windows, разработанного Агентством по охране окружающей среды США. (Доступно онлайн по адресу https://www.epa.gov/tsca-screening-tools/ecological-struct-activity-relationships-ecosar-predictive-model).
Все тесты на ларвицидную и антитермитную активность проводились в трех повторностях. Нелинейная регрессия (логарифм переменных доза-реакция) данных о смертности личинок и термитов была выполнена для расчета средней летальной концентрации (LC50) с 95% доверительным интервалом, а кривые концентрация-реакция были получены с использованием Prism® (версия 8.0, GraphPad Software) Inc., США) 84, 91.
Настоящее исследование раскрывает потенциал микробных биосурфактантов, продуцируемых Enterobacter cloacae SJ2, в качестве ларвицидных и антитермитных агентов для комаров, и эта работа будет способствовать лучшему пониманию механизмов ларвицидного и антитермитного действия. Гистологические исследования личинок, обработанных биосурфактантами, показали повреждение пищеварительного тракта, средней кишки, коры головного мозга и гиперплазию эпителиальных клеток кишечника. Результаты: Токсикологическая оценка антитермитной и ларвицидной активности рамнолипидного биосурфактанта, продуцируемого Enterobacter cloacae SJ2, показала, что этот изолят является потенциальным биопестицидом для борьбы с трансмиссивными заболеваниями комаров (Cx quinquefasciatus) и термитов (O. obesus). Необходимо понять лежащую в основе экологическую токсичность биосурфактантов и их потенциальное воздействие на окружающую среду. Данное исследование дает научную основу для оценки экологического риска биосурфактантов.
Время публикации: 09-04-2024