Сезонное распределение осадков в провинции Гуйчжоу неравномерно, с большим количеством осадков весной и летом, но всходы рапса подвержены стрессу засухи осенью и зимой, что серьезно влияет на урожайность. Горчица — это особая масличная культура, в основном выращиваемая в провинции Гуйчжоу. Она обладает высокой устойчивостью к засухе и может выращиваться в горных районах. Это богатый ресурс генов засухоустойчивости. Открытие генов засухоустойчивости имеет решающее значение для улучшения сортов горчицы и инноваций в ресурсах зародышевой плазмы. Семейство GRF играет решающую роль в росте и развитии растений и реакции на стресс засухи. В настоящее время гены GRF обнаружены у Arabidopsis 2, риса (Oryza sativa) 12, рапса 13, хлопка (Gossypium hirsutum) 14, пшеницы (Triticum). aestivum) 15, проса (Setaria italica) 16 и Brassica 17, но нет сообщений об обнаружении генов GRF у горчицы. В этом исследовании гены семейства GRF горчицы были идентифицированы на уровне всего генома, и были проанализированы их физические и химические характеристики, эволюционные связи, гомология, консервативные мотивы, структура генов, дупликации генов, цис-элементы и стадия проростка (стадия четырех листьев). Паттерны экспрессии в условиях стресса засухи были всесторонне проанализированы, чтобы обеспечить научную основу для дальнейших исследований потенциальной функции генов BjGRF в ответе на засуху и предоставить гены-кандидаты для селекции засухоустойчивой горчицы.
Тридцать четыре гена BjGRF были идентифицированы в геноме Brassica juncea с использованием двух поисков HMMER, все из которых содержат домены QLQ и WRC. Последовательности CDS идентифицированных генов BjGRF представлены в Дополнительной таблице S1. BjGRF01–BjGRF34 названы на основе их расположения на хромосоме. Физико-химические свойства этого семейства указывают на то, что длина аминокислот сильно варьируется и составляет от 261 а.о. (BjGRF19) до 905 а.о. (BjGRF28). Изоэлектрическая точка BjGRF варьируется от 6,19 (BjGRF02) до 9,35 (BjGRF03) со средним значением 8,33, и 88,24% BjGRF является основным белком. Прогнозируемый диапазон молекулярной массы BjGRF составляет от 29,82 кДа (BjGRF19) до 102,90 кДа (BjGRF28); индекс нестабильности белков BjGRF варьируется от 51,13 (BjGRF08) до 78,24 (BjGRF19), все они больше 40, что указывает на то, что индекс жирных кислот варьируется от 43,65 (BjGRF01) до 78,78 (BjGRF22), средняя гидрофильность (GRAVY) варьируется от -1,07 (BjGRF31) до -0,45 (BjGRF22), все гидрофильные белки BjGRF имеют отрицательные значения GRAVY, что может быть связано с отсутствием гидрофобности, вызванным остатками. Прогнозирование субклеточной локализации показало, что 31 белок, кодируемый BjGRF, может быть локализован в ядре, BjGRF04 может быть локализован в пероксисомах, BjGRF25 может быть локализован в цитоплазме, а BjGRF28 может быть локализован в хлоропластах (таблица 1), что указывает на то, что BjGRF могут быть локализованы в ядре и играть важную регуляторную роль в качестве фактора транскрипции.
Филогенетический анализ семейств GRF у разных видов может помочь в изучении функций генов. Поэтому были загружены полноразмерные аминокислотные последовательности 35 GRF рапса, 16 репы, 12 риса, 10 проса и 9 Arabidopsis, и на основе 34 идентифицированных генов BjGRF было построено филогенетическое дерево (рис. 1). Три подсемейства содержат разное количество членов; 116 TF GRF разделены на три разных подсемейства (группы A~C), содержащие 59 (50,86%), 34 (29,31%) и 23 (19,83)% GRF соответственно. Среди них 34 члена семейства BjGRF разбросаны по 3 подсемействам: 13 членов в группе A (38,24%), 12 членов в группе B (35,29%) и 9 членов в группе C (26,47%). В процессе полиплоидизации горчицы число генов BjGRFs в разных подсемействах различается, и могли произойти амплификация и потеря генов. Стоит отметить, что в группе C нет распределения GRF риса и проса, тогда как в группе B есть 2 GRF риса и 1 GRF проса, и большинство GRF риса и проса сгруппированы в одну ветвь, что указывает на то, что BjGRFs тесно связаны с двудольными. Среди них наиболее глубокие исследования функции GRF у Arabidopsis thaliana дают основу для функциональных исследований BjGRFs.
Филогенетическое дерево горчицы, включающее Brassica napus, Brassica napus, рис, просо и представителей семейства GRF Arabidopsis thaliana.
Анализ повторяющихся генов в семействе GRF горчицы. Серая линия на заднем плане представляет синхронизированный блок в геноме горчицы, красная линия представляет пару сегментированных повторов гена BjGRF;
Экспрессия гена BjGRF в условиях засухи на стадии четвертого листа. Данные qRT-PCR приведены в дополнительной таблице S5. Значительные различия в данных обозначены строчными буквами.
Поскольку глобальный климат продолжает меняться, изучение того, как сельскохозяйственные культуры справляются со стрессом засухи и улучшение механизмов их устойчивости, стало актуальной темой для исследований18. После засухи морфологическая структура, экспрессия генов и метаболические процессы растений изменятся, что может привести к прекращению фотосинтеза и нарушению метаболизма, что повлияет на урожайность и качество сельскохозяйственных культур19,20,21. Когда растения чувствуют сигналы засухи, они вырабатывают вторичные мессенджеры, такие как Ca2+ и фосфатидилинозитол, увеличивают внутриклеточную концентрацию ионов кальция и активируют регуляторную сеть пути фосфорилирования белков22,23. Конечный целевой белок напрямую участвует в клеточной защите или регулирует экспрессию связанных генов стресса через ТФ, повышая устойчивость растений к стрессу24,25. Таким образом, ТФ играют решающую роль в реагировании на стресс засухи. В соответствии с последовательностью и свойствами связывания ДНК ТФ, реагирующих на стресс засухи, ТФ можно разделить на различные семейства, такие как GRF, ERF, MYB, WRKY и другие семейства26.
Семейство генов GRF представляет собой тип специфичного для растений ТФ, который играет важную роль в различных аспектах, таких как рост, развитие, передача сигнала и защитные реакции растений27. С тех пор как первый ген GRF был идентифицирован в O. sativa28, все больше и больше генов GRF были идентифицированы во многих видах и, как было показано, влияют на рост, развитие и реакцию растений на стресс8, 29, 30,31,32. С публикацией последовательности генома Brassica juncea стала возможной идентификация семейства генов BjGRF33. В этом исследовании 34 гена BjGRF были идентифицированы во всем геноме горчицы и названы BjGRF01–BjGRF34 на основе их хромосомного положения. Все они содержат высококонсервативные домены QLQ и WRC. Анализ физико-химических свойств показал, что различия в количестве аминокислот и молекулярном весе белков BjGRF (кроме BjGRF28) не были значительными, что указывает на то, что члены семейства BjGRF могут иметь схожие функции. Анализ структуры гена показал, что 64,7% генов BjGRF содержали 4 экзона, что указывает на то, что структура гена BjGRF относительно консервативна в эволюции, но количество экзонов в генах BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 и BjGRF29 больше. Исследования показали, что добавление или удаление экзонов или интронов может привести к различиям в структуре и функции гена, тем самым создавая новые гены34,35,36. Поэтому мы предполагаем, что интрон BjGRF был утерян в ходе эволюции, что может вызвать изменения в функции гена. В соответствии с существующими исследованиями мы также обнаружили, что количество интронов было связано с экспрессией гена. Когда количество интронов в гене велико, ген может быстро реагировать на различные неблагоприятные факторы.
Дупликация генов является основным фактором геномной и генетической эволюции37. Связанные исследования показали, что дупликация генов не только увеличивает количество генов GRF, но и служит средством генерации новых генов, помогающих растениям адаптироваться к различным неблагоприятным условиям окружающей среды38. В этом исследовании было обнаружено в общей сложности 48 пар дублированных генов, все из которых были сегментными дупликациями, что указывает на то, что сегментные дупликации являются основным механизмом увеличения количества генов в этом семействе. В литературе сообщалось, что сегментная дупликация может эффективно способствовать амплификации членов семейства генов GRF у Arabidopsis и земляники, и ни у одного из видов не было обнаружено тандемной дупликации этого семейства генов27,39. Результаты этого исследования согласуются с существующими исследованиями по Arabidopsis thaliana и семействам земляники, предполагая, что семейство GRF может увеличивать количество генов и генерировать новые гены посредством сегментной дупликации у разных растений.
В этом исследовании в горчице было идентифицировано в общей сложности 34 гена BjGRF, которые были разделены на 3 подсемейства. Эти гены показали схожие консервативные мотивы и структуры генов. Анализ коллинеарности выявил 48 пар дупликаций сегментов в горчице. Промоторная область BjGRF содержит цис-действующие элементы, связанные с реакцией на свет, гормональной реакцией, реакцией на стресс окружающей среды, а также ростом и развитием. Экспрессия 34 генов BjGRF была обнаружена на стадии проростков горчицы (корни, стебли, листья), а также паттерн экспрессии 10 генов BjGRF в условиях засухи. Было обнаружено, что паттерны экспрессии генов BjGRF в условиях стресса засухи были схожи и могут быть схожими. участие в регуляции, вызывающей засуху. Гены BjGRF03 и BjGRF32 могут играть положительную регуляторную роль при стрессе засухи, в то время как BjGRF06 и BjGRF23 играют роль при стрессе засухи как целевые гены miR396. В целом наше исследование обеспечивает биологическую основу для будущего открытия функции гена BjGRF в растениях семейства Brassicaceae.
Семена горчицы, использованные в этом эксперименте, были предоставлены Гуйчжоуским институтом исследований семян масличных культур, Гуйчжоуской академией сельскохозяйственных наук. Выберите целые семена и посадите их в почву (субстрат: почва = 3:1), соберите корни, стебли и листья после стадии четырех листьев. Растения обрабатывали 20% ПЭГ 6000 для имитации засухи, а листья собирали через 0, 3, 6, 12 и 24 часа. Все образцы растений немедленно замораживали в жидком азоте, а затем хранили в морозильной камере при температуре -80°C для следующего теста.
Все данные, полученные или проанализированные в ходе данного исследования, включены в опубликованную статью и файлы дополнительной информации.
Время публикации: 22 января 2025 г.