Сезонное распределение осадков в провинции Гуйчжоу неравномерно, с большим количеством осадков весной и летом, но всходы рапса подвержены засухе осенью и зимой, что серьезно влияет на урожайность. Горчица — особая масличная культура, в основном выращиваемая в провинции Гуйчжоу. Она обладает высокой засухоустойчивостью и может выращиваться в горных районах. Она является богатым источником генов засухоустойчивости. Открытие генов засухоустойчивости имеет решающее значение для улучшения сортов горчицы и инноваций в области генетических ресурсов. Семейство GRF играет важную роль в росте и развитии растений, а также в их реакции на засуху. В настоящее время гены GRF обнаружены у Arabidopsis 2, риса (Oryza sativa) 12, рапса 13, хлопка (Gossypium hirsutum) 14, пшеницы (Triticum aestivum) 15, проса (Setaria italica) 16 и Brassica 17, но сообщений об обнаружении генов GRF у горчицы нет. В данном исследовании были идентифицированы гены семейства GRF горчицы на геномном уровне, а также проанализированы их физико-химические характеристики, эволюционные взаимосвязи, гомология, консервативные мотивы, структура генов, дупликации генов, цис-элементы и стадия развития сеянца (стадия четырех листьев). Были всесторонне проанализированы закономерности экспрессии в условиях засухи, что позволило создать научную основу для дальнейших исследований потенциальной функции генов BjGRF в реакции на засуху и определить гены-кандидаты для селекции засухоустойчивой горчицы.
С помощью двух поисков HMMER в геноме Brassica juncea было идентифицировано тридцать четыре гена BjGRF, все из которых содержат домены QLQ и WRC. Последовательности кодирующих последовательностей (CDS) идентифицированных генов BjGRF представлены в дополнительной таблице S1. Гены BjGRF01–BjGRF34 названы в соответствии с их расположением на хромосоме. Физико-химические свойства этого семейства указывают на высокую вариабельность длины аминокислотных остатков, варьирующуюся от 261 аминокислоты (BjGRF19) до 905 аминокислот (BjGRF28). Изоэлектрическая точка BjGRF колеблется от 6,19 (BjGRF02) до 9,35 (BjGRF03) со средним значением 8,33, и 88,24% BjGRF представляют собой основной белок. Предполагаемый диапазон молекулярной массы BjGRF составляет от 29,82 кДа (BjGRF19) до 102,90 кДа (BjGRF28); индекс нестабильности белков BjGRF варьируется от 51,13 (BjGRF08) до 78,24 (BjGRF19), все значения превышают 40, что указывает на диапазон индекса жирных кислот от 43,65 (BjGRF01) до 78,78 (BjGRF22), средняя гидрофильность (GRAVY) варьируется от -1,07 (BjGRF31) до -0,45 (BjGRF22), все гидрофильные белки BjGRF имеют отрицательные значения GRAVY, что может быть связано с недостаточной гидрофобностью, обусловленной остатками. Прогнозирование субклеточной локализации показало, что 31 белок, кодируемый геном BjGRF, может локализоваться в ядре, BjGRF04 — в пероксисомах, BjGRF25 — в цитоплазме, а BjGRF28 — в хлоропластах (таблица 1), что указывает на то, что белки BjGRF могут локализоваться в ядре и играть важную регуляторную роль в качестве транскрипционного фактора.
Филогенетический анализ семейств GRF у разных видов может помочь в изучении функций генов. Поэтому были загружены полные аминокислотные последовательности 35 генов GRF рапса, 16 генов репы, 12 генов риса, 10 генов проса и 9 генов арабидопсиса, и на основе 34 идентифицированных генов BjGRF было построено филогенетическое дерево (рис. 1). Три подсемейства содержат различное количество членов; 116 транскрипционных факторов GRF разделены на три различных подсемейства (группы A~C), содержащие 59 (50,86%), 34 (29,31%) и 23 (19,83%)% генов GRF соответственно. Среди них 34 члена семейства BjGRF распределены по 3 подсемействам: 13 членов в группе A (38,24%), 12 членов в группе B (35,29%) и 9 членов в группе C (26,47%). В процессе полиплоидизации горчицы количество генов BjGRF в разных подсемействах различается, и могут происходить амплификация и потеря генов. Стоит отметить, что в группе C отсутствует распределение генов GRF риса и проса, в то время как в группе B имеется 2 гена GRF риса и 1 ген GRF проса, и большинство генов GRF риса и проса сгруппированы в одну ветвь, что указывает на тесную связь генов BjGRF с двудольными растениями. Среди них наиболее углубленные исследования функции генов GRF у Arabidopsis thaliana обеспечивают основу для функциональных исследований генов BjGRF.
Филогенетическое дерево горчицы, включающее Brassica napus, Brassica napus, рис, просо и представителей семейства GRF Arabidopsis thaliana.
Анализ повторяющихся генов в семействе GRF горчицы. Серая линия на фоне представляет собой синхронизированный блок в геноме горчицы, красная линия — пару сегментированных повторов гена BjGRF;
Экспрессия гена BjGRF в условиях засухи на стадии четвертого листа. Данные qRT-PCR представлены в дополнительной таблице S5. Значимые различия в данных обозначены строчными буквами.
Поскольку глобальный климат продолжает меняться, изучение того, как сельскохозяйственные культуры справляются с засухой, и совершенствование механизмов их толерантности стали актуальной темой исследований18. После засухи морфологическая структура, экспрессия генов и метаболические процессы растений изменяются, что может привести к прекращению фотосинтеза и метаболическим нарушениям, влияя на урожайность и качество сельскохозяйственных культур19,20,21. Когда растения чувствуют сигналы засухи, они продуцируют вторичные мессенджеры, такие как Ca2+ и фосфатидилинозитол, увеличивают внутриклеточную концентрацию ионов кальция и активируют регуляторную сеть пути фосфорилирования белков22,23. Конечный целевой белок непосредственно участвует в клеточной защите или регулирует экспрессию соответствующих стрессовых генов через транскрипционные факторы (ТФ), повышая толерантность растений к стрессу24,25. Таким образом, ТФ играют решающую роль в реагировании на засуху. В зависимости от последовательности и свойств связывания ДНК ТФ, реагирующих на засуху, можно разделить на различные семейства, такие как GRF, ERF, MYB, WRKY и другие семейства26.
Семейство генов GRF представляет собой тип специфичных для растений транскрипционных факторов, играющих важную роль в различных аспектах, таких как рост, развитие, передача сигналов и защитные реакции растений27. С момента идентификации первого гена GRF у O. sativa28, все больше и больше генов GRF было идентифицировано у многих видов и показано, что они влияют на рост, развитие растений и реакцию на стресс8, 29, 30, 31, 32. С публикацией последовательности генома Brassica juncea стала возможной идентификация семейства генов BjGRF33. В этом исследовании в геноме горчицы было идентифицировано 34 гена BjGRF, которые были названы BjGRF01–BjGRF34 на основе их хромосомного положения. Все они содержат высококонсервативные домены QLQ и WRC. Анализ физико-химических свойств показал, что различия в количестве аминокислот и молекулярной массе белков BjGRF (за исключением BjGRF28) незначительны, что указывает на то, что члены семейства BjGRF могут выполнять схожие функции. Анализ структуры генов показал, что 64,7% генов BjGRF содержат 4 экзона, что указывает на относительную консервативность структуры генов BjGRF в процессе эволюции, тогда как количество экзонов в генах BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 и BjGRF29 больше. Исследования показали, что добавление или удаление экзонов или интронов может приводить к различиям в структуре и функции генов, создавая тем самым новые гены34,35,36. Поэтому мы предполагаем, что интрон BjGRF был утрачен в процессе эволюции, что может вызывать изменения в функции гена. В соответствии с существующими исследованиями, мы также обнаружили, что количество интронов связано с экспрессией гена. Когда количество интронов в гене велико, ген может быстро реагировать на различные неблагоприятные факторы.
Дублирование генов является важным фактором геномной и генетической эволюции37. Соответствующие исследования показали, что дублирование генов не только увеличивает количество генов GRF, но и служит средством генерации новых генов, помогающих растениям адаптироваться к различным неблагоприятным условиям окружающей среды38. В этом исследовании было обнаружено в общей сложности 48 пар дублированных генов, все из которых представляли собой сегментарные дупликации, что указывает на то, что сегментарные дупликации являются основным механизмом увеличения числа генов в этом семействе. В литературе сообщалось, что сегментарная дупликация может эффективно способствовать амплификации членов семейства генов GRF у Arabidopsis и земляники, и ни у одного из видов не было обнаружено тандемных дупликаций этого семейства генов27,39. Результаты этого исследования согласуются с существующими исследованиями семейств Arabidopsis thaliana и земляники, предполагая, что семейство GRF может увеличивать количество генов и генерировать новые гены посредством сегментарной дупликации у разных растений.
В данном исследовании было идентифицировано в общей сложности 34 гена BjGRF у горчицы, которые были разделены на 3 подсемейства. Эти гены показали сходные консервативные мотивы и генные структуры. Анализ коллинеарности выявил 48 пар дублированных сегментов у горчицы. Промоторная область BjGRF содержит цис-действующие элементы, связанные с реакцией на свет, гормональную реакцию, реакцию на стресс окружающей среды, а также рост и развитие. Экспрессия 34 генов BjGRF была обнаружена на стадии проростка горчицы (корни, стебли, листья), а также была изучена картина экспрессии 10 генов BjGRF в условиях засухи. Было установлено, что картины экспрессии генов BjGRF в условиях засухи были схожими и, возможно, имеют сходное участие в регуляции засухи. Гены BjGRF03 и BjGRF32 могут играть положительную регуляторную роль в условиях засухи, в то время как BjGRF06 и BjGRF23 играют роль целевых генов miR396 в условиях засухи. В целом, наше исследование обеспечивает биологическую основу для будущих исследований функции гена BjGRF у растений семейства Brassicaceae.
Семена горчицы, использованные в этом эксперименте, были предоставлены Гуйчжоуским научно-исследовательским институтом масличных культур Гуйчжоуской академии сельскохозяйственных наук. Были отобраны целые семена, которые высажены в почву (соотношение субстрат:почва = 3:1), а корни, стебли и листья собраны после стадии четырех листьев. Растения обрабатывали 20% раствором ПЭГ 6000 для имитации засухи, а листья собирали через 0, 3, 6, 12 и 24 часа. Все образцы растений были немедленно заморожены в жидком азоте, а затем хранились в морозильной камере при температуре -80°C до проведения следующего эксперимента.
Все данные, полученные или проанализированные в ходе данного исследования, включены в опубликованную статью и дополнительные информационные файлы.
Дата публикации: 22 января 2025 г.