Сосновая нематода — карантинный мигрирующий эндопаразит, известный тем, что вызывает серьезные экономические потери в сосновых лесных экосистемах. В данном исследовании рассматривается нематоцидная активность галогенированных индолов против сосновых нематод и механизм их действия. Нематоцидная активность 5-йодоиндола и авермектина (положительный контроль) против сосновых нематод была сходной и высокой при низких концентрациях (10 мкг/мл). 5-йодоиндол снижал плодовитость, репродуктивную активность, эмбриональную и личиночную смертность, а также двигательную активность. Молекулярные взаимодействия лигандов с глутамат-зависимыми рецепторами хлоридных каналов, специфичными для беспозвоночных, подтверждают предположение о том, что 5-йодоиндол, подобно авермектину, прочно связывается с активным центром рецептора. 5-йодоиндол также вызывал различные фенотипические деформации у нематод, включая аномальное разрушение/уменьшение органов и усиление вакуолизации. Эти результаты позволяют предположить, что вакуоли могут играть роль в гибели нематод, опосредованной метилированием. Важно отметить, что 5-йодоиндол был нетоксичен для обоих видов растений (капусты и редиса). Таким образом, это исследование демонстрирует, что применение йодоиндола в условиях окружающей среды может контролировать повреждения, вызываемые увяданием сосны.
Сосновая древесная нематода (Bursaphelenchus xylophilus) относится к сосновым древесным нематодам (СДН), мигрирующим эндопаразитическим нематодам, известным тем, что наносят серьезный экологический ущерб сосновым лесам1. Болезнь увядания сосны (БУС), вызываемая сосновой древесной нематодой, становится серьезной проблемой на нескольких континентах, включая Азию и Европу, а в Северной Америке эта нематода уничтожает интродуцированные виды сосны1,2. Упадок сосен является серьезной экономической проблемой, и перспектива его глобального распространения вызывает беспокойство3. Следующие виды сосны чаще всего поражаются этой нематодой: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii и Pinus radiata4. Сосновая нематода — это серьезное заболевание, которое может привести к гибели сосен в течение нескольких недель или месяцев после заражения. Кроме того, вспышки сосновой нематоды распространены в различных экосистемах, поэтому сформировались устойчивые цепочки заражения1.
Bursaphelenchus xylophilus — карантинная растительноядная нематода, принадлежащая к надсемейству Aphelenchoidea и кладе 102.5. Нематода питается грибами и размножается в древесных тканях сосен, развиваясь в четыре различные личиночные стадии: L1, L2, L3, L4 и взрослую особь1,6. В условиях нехватки пищи сосновая нематода переходит в специализированную личиночную стадию — дауэр, которая паразитирует на её переносчике — сосновом короеде (Monochamus alternatus) — и переносится на здоровые сосны. В здоровых растениях нематоды быстро мигрируют через растительные ткани и питаются паренхиматозными клетками, что приводит к ряду реакций гиперчувствительности, увяданию сосны и гибели в течение года после заражения1,7,8.
Биологический контроль сосновых нематод долгое время представлял собой сложную задачу, а карантинные меры применялись еще в XX веке. Современные стратегии борьбы с сосновыми нематодами в основном включают химическую обработку, в том числе фумигацию древесины и имплантацию нематицидов в стволы деревьев. Наиболее часто используемыми нематицидами являются авермектин и бензоат авермектина, которые относятся к семейству авермектинов. Эти дорогостоящие химические вещества высокоэффективны против многих видов нематод и считаются экологически безопасными9. Однако ожидается, что многократное использование этих нематицидов создаст селективное давление, которое почти наверняка приведет к появлению устойчивых сосновых нематод, как это было продемонстрировано на примере нескольких насекомых-вредителей, таких как Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella и нематоды Trichostrongylus colubriformis и Ostertagia circumcincta, которые постепенно выработали устойчивость к авермектинам10,11,12. Поэтому необходимо регулярно изучать закономерности резистентности и постоянно проводить скрининг нематицидов, чтобы найти альтернативные, экономически эффективные и экологически безопасные меры по борьбе с PVD. В последние десятилетия ряд авторов предложили использовать растительные экстракты, эфирные масла и летучие вещества в качестве средств борьбы с нематодами13,14,15,16.
Недавно мы продемонстрировали нематоцидную активность индола, межклеточной и межцарственной сигнальной молекулы, у Caenorhabditis elegans 17. Индол является широко распространенным внутриклеточным сигналом в микробной экологии, контролирующим многочисленные функции, влияющие на микробную физиологию, образование спор, стабильность плазмид, лекарственную устойчивость, образование биопленок и вирулентность 18, 19. Активность индола и его производных против других патогенных нематод не изучалась. В этом исследовании мы изучили нематоцидную активность 34 индолов против сосновых нематод и выяснили механизм действия наиболее эффективного 5-йодоиндола с помощью микроскопии, покадровой съемки и экспериментов по молекулярному докингу, а также оценили его токсическое воздействие на растения с помощью анализа прорастания семян.
Ранее сообщалось, что высокие концентрации индола (>1,0 мМ) оказывают нематоцидное действие на нематод17. После обработки B. xylophilus (на разных стадиях развития) индолом или 33 различными производными индола в концентрации 1 мМ, смертность B. xylophilus измеряли путем подсчета живых и мертвых нематод в контрольной и обработанной группах. Пять индолов продемонстрировали значительную нематоцидную активность; выживаемость необработанной контрольной группы составила 95 ± 7% через 24 часа. Из 34 протестированных индолов 5-йодоиндол и 4-фториндол в концентрации 1 мМ вызывали 100% смертность, тогда как 5,6-дифториндиго, метилиндол-7-карбоксилат и 7-йодоиндол вызывали приблизительно 50% смертность (таблица 1).
Влияние 5-йодоиндола на образование вакуолей и метаболизм сосновой древесной нематоды. (A) Влияние авермектина и 5-йодоиндола на взрослых самцов нематод, (B) яйца нематод стадии L1 и (C) метаболизм B. xylophilus: (i) вакуоли не наблюдались через 0 ч, обработка привела к (ii) образованию вакуолей, (iii) накоплению множественных вакуолей, (iv) набуханию вакуолей, (v) слиянию вакуолей и (vi) образованию гигантских вакуолей. Красные стрелки указывают на набухание вакуолей, синие стрелки — на слияние вакуолей, а черные стрелки — на гигантские вакуоли. Масштабная линейка = 50 мкм.
Кроме того, в этом исследовании также описан последовательный процесс гибели сосновых нематод, вызванной метаном (рисунок 4C). Метаногенная гибель — это неапоптотический тип клеточной смерти, связанный с накоплением крупных цитоплазматических вакуолей27. Морфологические дефекты, наблюдаемые у сосновых нематод, по-видимому, тесно связаны с механизмом гибели, вызванной метаном. Микроскопическое исследование в разное время показало, что гигантские вакуоли образовывались после 20 часов воздействия 5-йодоиндола (0,1 мМ). Микроскопические вакуоли наблюдались после 8 часов обработки, и их количество увеличивалось после 12 часов. Несколько крупных вакуолей наблюдались после 14 часов. Несколько слившихся вакуолей были четко видны после 12–16 часов обработки, что указывает на то, что слияние вакуолей лежит в основе механизма метаногенной гибели. После 20 часов по всему червю было обнаружено несколько гигантских вакуолей. Эти наблюдения представляют собой первое сообщение о метуозе у C. elegans.
У червей, обработанных 5-йодоиндолом, также наблюдалось агрегирование и разрыв вакуолей (рис. 5), о чем свидетельствует изгиб червя и высвобождение вакуолей в окружающую среду. Разрушение вакуолей также наблюдалось в мембране яичной скорлупы, которая обычно сохраняется неповрежденной к стадии L2 во время вылупления (дополнительный рис. S2). Эти наблюдения подтверждают участие накопления жидкости и нарушения осморегуляторной функции, а также обратимого повреждения клеток (RCI) в процессе образования и нагноения вакуолей (рис. 5).
Предполагая роль йода в наблюдаемом образовании вакуолей, мы исследовали нематоцидную активность йодида натрия (NaI) и йодида калия (KI). Однако при концентрациях (0,1, 0,5 или 1 мМ) они не влияли ни на выживаемость нематод, ни на образование вакуолей (дополнительный рис. S5), хотя 1 мМ KI оказывал незначительное нематоцидное действие. С другой стороны, 7-йодоиндол (1 или 2 мМ), как и 5-йодоиндол, вызывал образование множественных вакуолей и структурные деформации (дополнительный рис. S6). Два йодоиндола демонстрировали сходные фенотипические характеристики у сосновых нематод, тогда как NaI и KI — нет. Интересно, что индол не вызывал образования вакуолей у B. xylophilus при исследованных концентрациях (данные не показаны). Таким образом, результаты подтвердили, что индол-йодный комплекс отвечает за вакуолизацию и метаболизм B. xylophilus.
Среди индолов, протестированных на нематоцидную активность, 5-йодоиндол имел самый высокий индекс скольжения -5,89 ккал/моль, за ним следовали 7-йодоиндол (-4,48 ккал/моль), 4-фториндол (-4,33) и индол (-4,03) (рис. 6). Сильная водородная связь основной цепи 5-йодоиндола с лейцином 218 стабилизирует его связывание, тогда как все остальные производные индола связываются с серином 260 посредством водородных связей боковой цепи. Среди других смоделированных иодоиндолов, 2-иодоиндол имеет значение связывания -5,248 ккал/моль, что обусловлено его основной водородной связью с лейцином 218. Другие известные значения связывания включают 3-иодоиндол (-4,3 ккал/моль), 4-иодоиндол (-4,0 ккал/моль) и 6-фториндол (-2,6 ккал/моль) (дополнительный рисунок S8). Большинство галогенированных индолов и сам индол, за исключением 5-йодоиндола и 2-йодоиндола, образуют связь с серином 260. Тот факт, что водородная связь с лейцином 218 указывает на эффективное связывание рецептора с лигандом, как это наблюдалось для ивермектина (дополнительный рис. S7), подтверждает, что 5-йодоиндол и 2-йодоиндол, подобно ивермектину, прочно связываются с активным центром рецептора GluCL через лейцин 218 (рис. 6 и дополнительный рис. S8). Мы предполагаем, что это связывание необходимо для поддержания открытой структуры поры комплекса GluCL и что, прочно связываясь с активным центром рецептора GluCL, 5-йодоиндол, 2-йодоиндол, авермектин и ивермектин таким образом поддерживают ионный канал открытым и позволяют осуществлять поглощение жидкости.
Молекулярный докинг индола и галогенированного индола к GluCL. Ориентации связывания лигандов (A) индола, (B) 4-фториндола, (C) 7-йодоиндола и (D) 5-йодоиндола с активным центром GluCL. Белок представлен лентой, а водородные связи основной цепи показаны желтыми пунктирными линиями. (A′), (B′), (C′) и (D′) показывают взаимодействия соответствующих лигандов с окружающими аминокислотными остатками, а водородные связи боковых цепей обозначены розовыми пунктирными стрелками.
Были проведены эксперименты для оценки токсического воздействия 5-йодоиндола на прорастание семян капусты и редиса. 5-йодоиндол (0,05 или 0,1 мМ) или авермектин (10 мкг/мл) оказывали незначительное или нулевое влияние на начальное прорастание и появление ростков (рис. 7). Кроме того, не было обнаружено существенной разницы между скоростью прорастания необработанных контрольных образцов и семян, обработанных 5-йодоиндолом или авермектином. Влияние на удлинение главного корня и количество образовавшихся боковых корней было незначительным, хотя 1 мМ (в 10 раз превышающая активную концентрацию) 5-йодоиндола незначительно замедлял развитие боковых корней. Эти результаты показывают, что 5-йодоиндол нетоксичен для растительных клеток и не влияет на процессы развития растений при изученных концентрациях.
Влияние 5-йодоиндола на прорастание семян. Прорастание, всходы и боковое укоренение семян B. oleracea и R. raphanistrum на агаровой среде Мурасиге и Скога с авермектином или 5-йодоиндолом или без них. Прорастание регистрировали после 3 дней инкубации при 22 °C.
В этом исследовании описаны несколько случаев гибели нематод под действием индолов. Важно отметить, что это первое сообщение о том, что йодоиндол вызывает метилирование (процесс, вызванный накоплением мелких вакуолей, которые постепенно сливаются в гигантские вакуоли, в конечном итоге приводя к разрыву мембраны и гибели) в сосновых иголках, при этом йодоиндол проявляет значительные нематицидные свойства, аналогичные свойствам коммерческого нематицида авермектина.
Ранее сообщалось, что индолы выполняют множество сигнальных функций в прокариотах и эукариотах, включая ингибирование/образование биопленок, выживание бактерий и патогенность19,32,33,34. В последнее время потенциальные терапевтические эффекты галогенированных индолов, индольных алкалоидов и полусинтетических производных индола привлекли значительный исследовательский интерес35,36,37. Например, было показано, что галогенированные индолы уничтожают персистирующие клетки Escherichia coli и Staphylococcus aureus37. Кроме того, представляет научный интерес изучение эффективности галогенированных индолов против других видов, родов и царств, и данное исследование является шагом к достижению этой цели.
Здесь мы предлагаем механизм летального исхода, вызванного 5-йодоиндолом у C. elegans, основанный на обратимом повреждении клеток (ОПК) и метилировании (рисунки 4C и 5). Отечные изменения, такие как отечность и вакуолярная дегенерация, являются индикаторами ОПК и метилирования, проявляющимися в виде гигантских вакуолей в цитоплазме48,49. ОПК препятствует выработке энергии, снижая производство АТФ, вызывая сбой в работе АТФазного насоса или разрушая клеточные мембраны и вызывая быстрый приток Na+, Ca2+ и воды50,51,52. Внутрицитоплазматические вакуоли возникают в клетках животных в результате накопления жидкости в цитоплазме из-за притока Ca2+ и воды53. Интересно, что этот механизм повреждения клеток обратим, если повреждение носит временный характер и клетки начинают производить АТФ в течение определенного периода времени, но если повреждение сохраняется или усугубляется, клетки погибают.54 Наши наблюдения показывают, что нематоды, обработанные 5-йодоиндолом, не способны восстановить нормальный биосинтез после воздействия стрессовых условий.
Фенотип метилирования, индуцированный 5-йодоиндолом в B. xylophilus, может быть обусловлен присутствием йода и его молекулярным распределением, поскольку 7-йодоиндол оказывал меньшее ингибирующее действие на B. xylophilus, чем 5-йодоиндол (таблица 1 и дополнительный рисунок S6). Эти результаты частично согласуются с исследованиями Мальтезе и др. (2014), которые сообщили, что перемещение пиридильного азотного фрагмента в индоле из пара- в мета-положение устраняет вакуолизацию, ингибирование роста и цитотоксичность в клетках U251, предполагая, что взаимодействие молекулы со специфическим активным центром в белке имеет решающее значение27,44,45. Наблюдаемые в данном исследовании взаимодействия между индолом или галогенированными индолами и рецепторами GluCL также подтверждают это предположение, поскольку было обнаружено, что 5- и 2-йодоиндол связываются с рецепторами GluCL сильнее, чем другие исследованные индолы (рисунок 6 и дополнительный рисунок S8). Было установлено, что йод во второй или пятой позиции индола связывается с лейцином 218 рецептора GluCL посредством водородных связей основной цепи, тогда как другие галогенированные индолы и сам индол образуют слабые водородные связи боковой цепи с серином 260 (рисунок 6). Поэтому мы предполагаем, что локализация галогена играет важную роль в индукции вакуолярной дегенерации, тогда как прочное связывание 5-йодоиндола поддерживает ионный канал открытым, тем самым обеспечивая быстрый приток жидкости и разрыв вакуоли. Однако подробный механизм действия 5-йодоиндола еще предстоит определить.
Перед практическим применением 5-йодоиндола необходимо проанализировать его токсическое воздействие на растения. Наши эксперименты по прорастанию семян показали, что 5-йодоиндол не оказывает негативного влияния на прорастание семян или последующие процессы развития при изученных концентрациях (рис. 7). Таким образом, данное исследование закладывает основу для использования 5-йодоиндола в экологической среде для контроля вредного воздействия сосновых нематод на сосны.
Предыдущие исследования показали, что терапия на основе индолов представляет собой потенциальный подход к решению проблемы антибиотикорезистентности и прогрессирования рака55. Кроме того, индолы обладают антибактериальной, противораковой, антиоксидантной, противовоспалительной, противодиабетической, противовирусной, антипролиферативной и противотуберкулезной активностью и могут служить перспективной основой для разработки лекарственных препаратов56,57. Данное исследование впервые предполагает потенциальное использование йода в качестве противопаразитарного и противогельминтного средства.
Авермектин был открыт три десятилетия назад и удостоен Нобелевской премии в 2015 году, и его использование в качестве антигельминтного средства до сих пор активно продолжается. Однако из-за быстрого развития устойчивости к авермектинам у нематод и насекомых-вредителей необходима альтернативная, недорогая и экологически чистая стратегия борьбы с заражением сосновых деревьев нематодами. В этом исследовании также описывается механизм, посредством которого 5-йодоиндол убивает сосновых нематод, и показано, что 5-йодоиндол обладает низкой токсичностью для растительных клеток, что открывает хорошие перспективы для его будущего коммерческого применения.
Все эксперименты были одобрены Комитетом по этике Университета Ённам, Кёнсан, Корея, и методы проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по этике Университета Ённам.
Эксперименты по инкубации яиц проводились с использованием установленных процедур43. Для оценки скорости вылупления (HR) однодневных взрослых нематод (приблизительно 100 самок и 100 самцов) переносили в чашки Петри, содержащие гриб, и давали им расти в течение 24 часов. Затем яйца изолировали и обрабатывали 5-йодоиндолом (0,05 мМ и 0,1 мМ) или авермектином (10 мкг/мл) в виде суспензии в стерильной дистиллированной воде. Эти суспензии (500 мкл; приблизительно 100 яиц) переносили в лунки 24-луночного планшета для культивирования тканей и инкубировали при 22 °C. Подсчет личинок L2 проводили через 24 часа инкубации, но клетки считались мертвыми, если они не двигались при стимуляции тонкой платиновой проволокой. Этот эксперимент проводился в два этапа, каждый с шестью повторениями. Данные обоих экспериментов были объединены и представлены. Процентное соотношение ЧСС рассчитывается следующим образом:
Смертность личинок оценивали с использованием ранее разработанных методик. Яйца нематод собирали, а эмбрионы синхронизировали путем вылупления в стерильной дистиллированной воде для получения личинок стадии L2. Синхронизированные личинки (приблизительно 500 нематод) обрабатывали 5-йодоиндолом (0,05 мМ и 0,1 мМ) или авермектином (10 мкг/мл) и выращивали на чашках Петри с B. cinerea. После 48 часов инкубации при 22 °C нематоды собирали в стерильную дистиллированную воду и исследовали на наличие стадий L2, L3 и L4. Наличие стадий L3 и L4 указывало на личиночную трансформацию, тогда как наличие стадии L2 указывало на отсутствие трансформации. Изображения получали с помощью цифровой системы визуализации клеток iRiS™. Эксперимент проводили в два этапа, каждый с шестью повторениями. Данные обоих экспериментов были объединены и представлены.
Токсичность 5-йодоиндола и авермектина для семян оценивали с помощью тестов на прорастание на агаровых пластинах Мурасиге и Скога.62 Семена B. oleracea и R. raphanistrum сначала замачивали в стерильной дистиллированной воде в течение одного дня, промывали 1 мл 100% этанола, стерилизовали 1 мл 50% коммерческого отбеливателя (3% гипохлорита натрия) в течение 15 минут и промывали пять раз 1 мл стерильной воды. Затем стерилизованные семена прижимали к агаровым пластинам для прорастания, содержащим 0,86 г/л (0,2X) среды Мурасиге и Скога и 0,7% бактериологического агара с 5-йодоиндолом или авермектином или без них. Затем пластины инкубировали при 22 °C, и изображения делали через 3 дня инкубации. Этот эксперимент проводили в два этапа, каждый из которых имел шесть повторений.
Дата публикации: 26 февраля 2025 г.