Сосновая нематода – карантинный мигрирующий эндопаразит, известный тем, что наносит серьёзный экономический ущерб экосистемам сосновых лесов. В настоящем исследовании рассматривается нематицидная активность галогенированных индолов против сосновых нематод и механизм их действия. Нематицидная активность 5-йодоиндола и авермектина (положительный контроль) против сосновых нематод была схожей и высокой при низких концентрациях (10 мкг/мл). 5-йодоиндол снижал плодовитость, репродуктивную активность, смертность эмбрионов и личинок, а также локомоторное поведение. Молекулярные взаимодействия лигандов со специфичными для беспозвоночных глутамат-зависимыми хлоридными рецепторами каналов подтверждают представление о том, что 5-йодоиндол, подобно авермектину, прочно связывается с активным центром рецептора. 5-йодоиндол также вызывал различные фенотипические деформации у нематод, включая аномальный коллапс/сморщивание органов и повышенную вакуолизацию. Эти результаты свидетельствуют о том, что вакуоли могут играть роль в гибели нематод, вызванной метилированием. Важно отметить, что 5-йодоиндол оказался нетоксичен для обоих видов растений (капусты и редиса). Таким образом, данное исследование демонстрирует, что применение йодоиндола в условиях окружающей среды может контролировать поражение хвойным увяданием.
Сосновая стволовая нематода (Bursaphelenchus xylophilus) относится к сосновым стволовым нематодам (PWN), мигрирующим эндопаразитическим нематодам, которые, как известно, наносят серьезный экологический ущерб экосистемам сосновых лесов1. Заболевание увяданием сосны (PWD), вызываемое сосновой стволовой нематодой, становится серьезной проблемой на нескольких континентах, включая Азию и Европу, а в Северной Америке нематода уничтожает интродуцированные виды сосны1,2. Увядание сосны является серьезной экономической проблемой, и перспектива ее глобального распространения вызывает беспокойство3. Следующие виды сосен чаще всего подвергаются нападению нематоды: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii и Pinus radiata4. Сосновая нематода — серьезное заболевание, которое может убить сосны в течение недель или месяцев после заражения. Кроме того, вспышки сосновой нематоды распространены в различных экосистемах, поэтому были установлены устойчивые цепочки заражения1.
Bursaphelenchus xylophilus — карантинная фитопаразитическая нематода, относящаяся к надсемейству Aphelenchoidea и кладе 102.5. Нематода питается грибами и размножается в древесине сосны, развиваясь в четыре различные личиночные стадии: L1, L2, L3, L4 и взрослую особь1,6. В условиях дефицита пищи сосновая нематода переходит в специализированную личиночную стадию — дауэру, которая паразитирует на своем переносчике — сосновом короеде (Monochamus alternatus) и переносится на здоровые деревья сосны. В здоровых хозяевах нематоды быстро мигрируют по тканям растений и питаются паренхиматозными клетками, что приводит к ряду реакций гиперчувствительности, увяданию сосны и ее гибели в течение года после заражения1,7,8.
Биологический контроль сосновых нематод долгое время был проблемой, карантинные меры были приняты еще в XX веке. Современные стратегии борьбы с сосновыми нематодами в основном включают химическую обработку, включая фумигацию древесины и имплантацию нематицидов в стволы деревьев. Наиболее часто используемыми нематоцидами являются авермектин и авермектин бензоат, которые относятся к семейству авермектинов. Эти дорогостоящие химикаты высокоэффективны против многих видов нематод и считаются экологически безопасными9. Однако ожидается, что повторное использование этих нематицидов создаст давление отбора, которое почти наверняка приведет к появлению резистентных сосновых нематод, как это было продемонстрировано для нескольких насекомых-вредителей, таких как Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella и нематод Trichostrongylus colubriformis и Ostertagia circumcincta, которые постепенно развили резистентность к авермектинам10,11,12. Поэтому необходимо регулярно изучать закономерности резистентности и проводить непрерывный скрининг нематоцидов для поиска альтернативных, экономически эффективных и экологически безопасных методов борьбы с нематодами. В последние десятилетия ряд авторов предложили использовать растительные экстракты, эфирные масла и летучие вещества в качестве средств борьбы с нематодами13,14,15,16.
Недавно мы продемонстрировали нематицидную активность индола, межклеточной и межцарственной сигнальной молекулы, в Caenorhabditis elegans 17 . Индол является широко распространенным внутриклеточным сигналом в микробной экологии, контролируя многочисленные функции, которые влияют на микробную физиологию, образование спор, стабильность плазмид, устойчивость к лекарственным препаратам, образование биопленки и вирулентность 18, 19 . Активность индола и его производных против других патогенных нематод не изучалась. В этом исследовании мы исследовали нематицидную активность 34 индолов против сосновых нематод и выяснили механизм действия наиболее сильного 5-йодоиндола с помощью микроскопии, покадровой фотографии и экспериментов по молекулярному докингу, а также оценили его токсическое действие на растения с помощью анализа прорастания семян.
Ранее сообщалось, что высокие концентрации индола (>1,0 мМ) оказывают нематицидное действие на нематод17. После обработки B. xylophilus (смешанные стадии развития) индолом или 33 различными производными индола в концентрации 1 мМ смертность B. xylophilus измеряли путем подсчета живых и мертвых нематод в контрольной и обработанной группах. Пять индолов проявили значительную нематицидную активность; выживаемость необработанной контрольной группы составила 95 ± 7% через 24 часа. Из 34 протестированных индолов 5-йодоиндол и 4-фтороиндол в концентрации 1 мМ вызвали 100% смертность, тогда как 5,6-дифториндиго, метилиндол-7-карбоксилат и 7-йодоиндол вызвали приблизительно 50% смертность (таблица 1).
Влияние 5-йодоиндола на образование вакуолей и метаболизм сосновой нематоды. (A) Влияние авермектина и 5-йодоиндола на взрослых самцов нематод, (B) яйца нематод стадии L1 и (C) метаболизм B. xylophilus, (i) вакуоли не наблюдались в 0 ч, обработка привела к (ii) образованию вакуолей, (iii) накоплению множественных вакуолей, (iv) набуханию вакуолей, (v) слиянию вакуолей и (vi) образованию гигантских вакуолей. Красные стрелки указывают на набухание вакуолей, синие стрелки – на слияние вакуолей, а черные стрелки – на гигантские вакуоли. Масштабная линейка = 50 мкм.
Кроме того, в этом исследовании также описан последовательный процесс гибели, вызванной метаном, у сосновых нематод (рисунок 4C). Метаногенная смерть - это неапоптотический тип клеточной смерти, связанный с накоплением заметных цитоплазматических вакуолей27. Морфологические дефекты, наблюдаемые у сосновых нематод, по-видимому, тесно связаны с механизмом гибели, вызванной метаном. Микроскопическое исследование в разное время показало, что гигантские вакуоли образовались после 20 ч воздействия 5-йодоиндола (0,1 мМ). Микроскопические вакуоли были обнаружены после 8 ч обработки, и их количество увеличилось через 12 ч. Несколько крупных вакуолей были обнаружены через 14 ч. Несколько слившихся вакуолей были отчетливо видны после 12–16 ч обработки, что указывает на то, что слияние вакуолей является основой механизма метаногенной смерти. Через 20 ч несколько гигантских вакуолей были обнаружены по всему червю. Эти наблюдения представляют собой первое сообщение о метуозе у C. elegans.
У червей, обработанных 5-йодоиндолом, также наблюдалось агрегация и разрыв вакуолей (рис. 5), о чём свидетельствовало изгибание червя и выброс вакуолей в окружающую среду. Разрушение вакуолей также наблюдалось в мембране яйцевой скорлупы, которая в норме сохраняется целой в L2 во время вылупления (Дополнительный рис. S2). Эти наблюдения подтверждают участие накопления жидкости и нарушения осморегуляторной функции, а также обратимого повреждения клеток (RCI) в процессе образования вакуолей и нагноения (рис. 5).
Предположив роль йода в наблюдаемом образовании вакуолей, мы исследовали нематицидную активность йодида натрия (NaI) и йодида калия (KI). Однако в концентрациях (0,1, 0,5 или 1 мМ) они не влияли ни на выживаемость нематод, ни на образование вакуолей (Дополнительный рисунок S5), хотя 1 мМ KI оказывал слабое нематицидное действие. С другой стороны, 7-йодоиндол (1 или 2 мМ), подобно 5-йодоиндолу, индуцировал образование множественных вакуолей и структурные деформации (Дополнительный рисунок S6). Два йодоиндола показали схожие фенотипические характеристики у сосновых нематод, тогда как NaI и KI – нет. Интересно, что индол не индуцировал образование вакуолей у B. xylophilus в исследованных концентрациях (данные не представлены). Таким образом, результаты подтвердили, что комплекс индол-йода отвечает за вакуолизацию и метаболизм B. xylophilus.
Среди индолов, протестированных на нематоцидную активность, 5-йодоиндол имел самый высокий индекс скольжения –5,89 ккал/моль, за ним следуют 7-йодоиндол (–4,48 ккал/моль), 4-фториндол (–4,33) и индол (–4,03) (рисунок 6). Прочная водородная связь 5-йодоиндола с лейцином 218 в основной цепи стабилизирует его связывание, тогда как все остальные производные индола связываются с серином 260 посредством водородных связей в боковой цепи. Среди других смоделированных йодоиндолов 2-йодоиндол имеет связывающее значение -5,248 ккал/моль, что обусловлено его основной водородной связью с лейцином 218. Другие известные связывания включают 3-йодоиндол (-4,3 ккал/моль), 4-йодоиндол (-4,0 ккал/моль) и 6-фтороиндол (-2,6 ккал/моль) (дополнительный рисунок S8). Большинство галогенированных индолов и сам индол, за исключением 5-йодоиндола и 2-йодоиндола, образуют связь с серином 260. Тот факт, что водородная связь с лейцином 218 свидетельствует об эффективном связывании рецептора с лигандом, как это наблюдалось для ивермектина (Дополнительный рисунок S7), подтверждает, что 5-йодоиндол и 2-йодоиндол, подобно ивермектину, прочно связываются с активным центром рецептора GluCL через лейцин 218 (рис. 6 и Дополнительный рисунок S8). Мы предполагаем, что это связывание необходимо для поддержания открытой структуры пор комплекса GluCL и что, прочно связываясь с активным центром рецептора GluCL, 5-йодоиндол, 2-йодоиндол, авермектин и ивермектин, таким образом, поддерживают ионный канал открытым и обеспечивают поглощение жидкости.
Молекулярная стыковка индола и галогенированного индола с GluCL. Ориентации связывания лигандов (A) индола, (B) 4-фториндола, (C) 7-йодоиндола и (D) 5-йодоиндола с активным центром GluCL. Белок представлен лентой, а водородные связи в основной цепи показаны жёлтыми пунктирными линиями. (A′), (B′), (C′) и (D′) показывают взаимодействия соответствующих лигандов с окружающими аминокислотными остатками, а водородные связи в боковых цепях обозначены розовыми пунктирными стрелками.
Были проведены эксперименты по оценке токсического действия 5-йодоиндола на прорастание семян капусты и редиса. 5-йодоиндол (0,05 или 0,1 мМ) или авермектин (10 мкг/мл) не оказали или оказали незначительное влияние на начальное прорастание и появление всходов (рисунок 7). Кроме того, не было обнаружено существенной разницы между скоростью прорастания необработанных контролей и семян, обработанных 5-йодоиндолом или авермектином. Влияние на удлинение стержневого корня и количество образовавшихся боковых корней было незначительным, хотя 1 мМ (в 10 раз превышающее его активную концентрацию) 5-йодоиндола несколько задержало развитие боковых корней. Эти результаты свидетельствуют о том, что 5-йодоиндол нетоксичен для растительных клеток и не нарушает процессы развития растений в исследованных концентрациях.
Влияние 5-йодоиндола на прорастание семян. Прорастание, появление всходов и боковое укоренение семян B. oleracea и R. raphanistrum на агаризованной среде Мурасиге и Скуга с добавлением авермектина или 5-йодоиндола или без них. Всхожесть регистрировали через 3 дня инкубации при температуре 22°C.
В этом исследовании описаны несколько случаев гибели нематод под действием индолов. Важно отметить, что это первое сообщение о том, что йодоиндол вызывает метилирование (процесс, вызванный накоплением мелких вакуолей, которые постепенно сливаются в гигантские, что в конечном итоге приводит к разрыву мембраны и гибели) в сосновой хвое, при этом йодоиндол проявляет выраженные нематоцидные свойства, аналогичные свойствам коммерческого нематицида авермектина.
Ранее сообщалось о том, что индолы выполняют множество сигнальных функций у прокариот и эукариот, включая ингибирование/образование биопленки, выживание бактерий и патогенность19,32,33,34. В последнее время потенциальные терапевтические эффекты галогенированных индолов, индольных алкалоидов и полусинтетических производных индола привлекают широкий исследовательский интерес35,36,37. Например, было показано, что галогенированные индолы убивают персистирующие клетки Escherichia coli и Staphylococcus aureus37. Кроме того, представляет научный интерес изучение эффективности галогенированных индолов против других видов, родов и царств, и данное исследование является шагом к достижению этой цели.
В данной работе мы предлагаем механизм летальности C. elegans, вызванной 5-йодоиндолом, основанный на обратимом повреждении клеток (RCI) и метилировании (рисунки 4C и 5). Отёчные изменения, такие как отечность и вакуольная дегенерация, являются индикаторами RCI и метилирования, проявляющимися в виде гигантских вакуолей в цитоплазме48,49. RCI препятствует выработке энергии, снижая продукцию АТФ, вызывая нарушение работы АТФазного насоса или разрушая клеточные мембраны и вызывая быстрый приток Na+, Ca2+ и воды50,51,52. Внутрицитоплазматические вакуоли возникают в животных клетках в результате накопления жидкости в цитоплазме, вызванного притоком Ca2+ и воды53. Интересно, что этот механизм повреждения клеток обратим, если повреждение временное и клетки начинают вырабатывать АТФ в течение определенного периода времени, но если повреждение сохраняется или усугубляется, клетки погибают.54 Наши наблюдения показывают, что нематоды, обработанные 5-йодоиндолом, не способны восстановить нормальный биосинтез после воздействия стрессовых условий.
Фенотип метилирования, индуцированный 5-йодоиндолом у B. xylophilus, может быть обусловлен присутствием йода и его молекулярным распределением, поскольку 7-йодоиндол оказывал меньшее ингибирующее действие на B. xylophilus, чем 5-йодоиндол (таблица 1 и дополнительный рисунок S6). Эти результаты частично согласуются с исследованиями Мальтезе и соавторов (2014), которые сообщили, что транслокация пиридильного азотистого фрагмента индола из пара- в мета-положение устраняла вакуолизацию, ингибирование роста и цитотоксичность в клетках U251, что свидетельствует о критической роли взаимодействия молекулы с определенным активным центром белка27,44,45. Взаимодействия между индолом или галогенированными индолами и рецепторами GluCL, наблюдаемые в данном исследовании, также подтверждают это предположение, поскольку было обнаружено, что 5- и 2-йодоиндол связываются с рецепторами GluCL сильнее, чем другие исследованные индолы (Рисунок 6 и Дополнительный рисунок S8). Было обнаружено, что йод во втором или пятом положении индола связывается с лейцином 218 рецептора GluCL посредством водородных связей основной цепи, тогда как другие галогенированные индолы и сам индол образуют слабые водородные связи боковой цепи с серином 260 (Рисунок 6). Поэтому мы предполагаем, что локализация галогена играет важную роль в индукции вакуолярной дегенерации, тогда как прочное связывание 5-йодоиндола поддерживает ионный канал открытым, тем самым обеспечивая быстрый приток жидкости и разрыв вакуоли. Однако детальный механизм действия 5-йодоиндола еще предстоит определить.
Перед практическим применением 5-йодоиндола необходимо проанализировать его токсическое действие на растения. Проведенные нами эксперименты по прорастанию семян показали, что 5-йодоиндол в исследованных концентрациях не оказывает отрицательного влияния на прорастание семян и последующие процессы развития (рисунок 7). Таким образом, данное исследование дает основание для использования 5-йодоиндола в экологических целях для контроля вредоносности сосновых нематод на сосне.
Предыдущие исследования показали, что терапия на основе индолов представляет собой потенциальный подход к решению проблемы устойчивости к антибиотикам и прогрессирования рака55. Кроме того, индолы обладают антибактериальным, противораковым, антиоксидантным, противовоспалительным, противодиабетическим, противовирусным, антипролиферативным и противотуберкулезным действием и могут служить перспективной основой для разработки лекарственных препаратов56,57. Данное исследование впервые предполагает возможность использования йода в качестве противопаразитарного и антигельминтного средства.
Авермектин был открыт три десятилетия назад и удостоен Нобелевской премии в 2015 году, и его применение в качестве антигельминтного средства до сих пор активно продолжается. Однако в связи с быстрым развитием резистентности к авермектинам у нематод и насекомых-вредителей необходима альтернативная, недорогая и экологически безопасная стратегия борьбы с инфекцией PWN у сосен. В данном исследовании также описывается механизм уничтожения сосновых нематод 5-йодоиндола и указывается на его низкую токсичность для растительных клеток, что открывает хорошие перспективы для его будущего коммерческого применения.
Все эксперименты были одобрены Комитетом по этике Университета Ённам, Кёнсан, Корея, а методы проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по этике Университета Ённам.
Эксперименты по инкубации яиц проводились с использованием установленных процедур43. Для оценки скорости вылупления (HR) однодневные взрослые нематоды (примерно 100 самок и 100 самцов) переносились в чашки Петри, содержащие гриб, и росли в течение 24 часов. Затем яйца изолировались и обрабатывались 5-йодоиндолом (0,05 мМ и 0,1 мМ) или авермектином (10 мкг/мл) в виде суспензии в стерильной дистиллированной воде. Эти суспензии (500 мкл; примерно 100 яиц) переносились в лунки 24-луночного планшета для культивирования тканей и инкубировались при температуре 22 °C. Подсчет L2 производился через 24 часа инкубации, но клетки считались мертвыми, если они не двигались при стимуляции тонкой платиновой проволокой. Этот эксперимент проводился в два этапа, каждый с шестью повторениями. Данные обоих экспериментов были объединены и представлены. Процент HR рассчитывается следующим образом:
Смертность личинок оценивали с помощью ранее разработанных процедур. Яйца нематод собирали, и эмбрионы синхронизировали путем вылупления в стерильной дистиллированной воде для получения личинок стадии L2. Синхронизированные личинки (примерно 500 нематод) обрабатывали 5-йодоиндолом (0,05 мМ и 0,1 мМ) или авермектином (10 мкг/мл) и выращивали на чашках Петри с B. cinerea. Через 48 часов инкубации при 22 °C нематод собирали в стерильной дистиллированной воде и исследовали на наличие стадий L2, L3 и L4. Наличие стадий L3 и L4 указывало на личиночную трансформацию, тогда как наличие стадии L2 указывало на отсутствие трансформации. Изображения получали с помощью системы цифровой визуализации клеток iRiS™. Этот эксперимент проводился в два этапа, каждый с шестью повторениями. Данные обоих экспериментов были объединены и представлены.
Токсичность 5-йодоиндола и авермектина для семян оценивали с помощью тестов на прорастание на чашках с агаром Мурасиге и Скуга.62 Семена B. oleracea и R. raphanistrum сначала замачивали в стерильной дистиллированной воде в течение одних суток, промывали 1 мл 100% этанола, стерилизовали 1 мл 50% коммерческого отбеливателя (3% гипохлорита натрия) в течение 15 минут и промывали пять раз 1 мл стерильной воды. Стерилизованные семена затем прессовали на чашках с агаром для проращивания, содержащим 0,86 г/л (0,2X) среды Мурасиге и Скуга и 0,7% бактериологического агара с или без 5-йодоиндола или авермектина. Затем чашки инкубировали при 22 °C, и делали снимки через 3 дня инкубации. Этот эксперимент проводился в два этапа, каждый из которых имел шесть повторений.
Время публикации: 26 февраля 2025 г.