Сосновая нематода — карантинный мигрирующий эндопаразит, который, как известно, наносит серьезный экономический ущерб экосистемам сосновых лесов. В настоящем исследовании рассматривается нематицидная активность галогенированных индолов против сосновых нематод и механизм их действия. Нематицидная активность 5-йодоиндола и авермектина (положительный контроль) против сосновых нематод была схожей и высокой при низких концентрациях (10 мкг/мл). 5-йодоиндол снижал плодовитость, репродуктивную активность, смертность эмбрионов и личинок и локомоторное поведение. Молекулярные взаимодействия лигандов с рецепторами хлоридных каналов, управляемых глутаматом, специфичными для беспозвоночных, подтверждают представление о том, что 5-йодоиндол, как и авермектин, прочно связывается с активным сайтом рецептора. 5-йодоиндол также вызывал различные фенотипические деформации у нематод, включая аномальный коллапс/сморщивание органов и повышенную вакуолизацию. Эти результаты показывают, что вакуоли могут играть роль в смерти, вызванной метилированием нематод. Важно отметить, что 5-йодоиндол не токсичен для обоих видов растений (капусты и редиса). Таким образом, это исследование показывает, что применение йодоиндола в условиях окружающей среды может контролировать поражение хвойным увяданием.
Сосновая нематода (Bursaphelenchus xylophilus) относится к сосновым нематодам (PWN), мигрирующим эндопаразитическим нематодам, которые, как известно, наносят серьезный экологический ущерб экосистемам сосновых лесов1. Заболевание увяданием сосны (PWD), вызываемое сосновой нематодой, становится серьезной проблемой на нескольких континентах, включая Азию и Европу, а в Северной Америке нематода уничтожает интродуцированные виды сосны1,2. Усыхание сосны является серьезной экономической проблемой, и перспектива ее глобального распространения вызывает беспокойство3. Следующие виды сосны чаще всего подвергаются нападению нематоды: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii и Pinus radiata4. Сосновая нематода — серьезное заболевание, которое может убить сосну в течение недель или месяцев после заражения. Кроме того, вспышки нематодозов распространены в различных экосистемах, поэтому были установлены устойчивые цепочки заражения1.
Bursaphelenchus xylophilus — карантинная фито-паразитическая нематода, относящаяся к надсемейству Aphelenchoidea и кладе 102.5. Нематода питается грибами и размножается в древесных тканях сосен, развиваясь в четыре различные личиночные стадии: L1, L2, L3, L4 и взрослую особь1,6. В условиях нехватки пищи сосновая нематода переходит в специализированную личиночную стадию — дауэра, которая паразитирует на своем переносчике — сосновом короеде (Monochamus alternatus) и переносится на здоровые сосны. У здоровых хозяев нематоды быстро мигрируют по тканям растений и питаются паренхиматозными клетками, что приводит к ряду реакций гиперчувствительности, увяданию сосны и гибели в течение года после заражения1,7,8.
Биологический контроль нематод сосны долгое время был проблемой, карантинные меры были приняты еще в 20 веке. Современные стратегии борьбы с нематодами сосны в основном включают химическую обработку, включая фумигацию древесины и имплантацию нематицидов в стволы деревьев. Наиболее часто используемыми нематицидами являются авермектин и авермектинбензоат, которые относятся к семейству авермектинов. Эти дорогостоящие химикаты очень эффективны против многих видов нематод и считаются экологически безопасными9. Однако ожидается, что повторное использование этих нематицидов создаст давление отбора, которое почти наверняка приведет к появлению устойчивых нематод сосны, как это было продемонстрировано для нескольких насекомых-вредителей, таких как Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella и нематод Trichostrongylus colubriformis и Ostertagia circumcincta, которые постепенно выработали устойчивость к авермектинам10,11,12. Поэтому необходимо регулярно изучать модели резистентности и непрерывно проводить скрининг нематицидов, чтобы найти альтернативные, экономически эффективные и экологически безопасные меры по контролю PVD. В последние десятилетия ряд авторов предложили использовать растительные экстракты, эфирные масла и летучие вещества в качестве агентов контроля нематод13,14,15,16.
Недавно мы продемонстрировали нематицидную активность индола, межклеточной и межцарственной сигнальной молекулы, в Caenorhabditis elegans 17 . Индол является широко распространенным внутриклеточным сигналом в микробной экологии, контролируя многочисленные функции, которые влияют на микробную физиологию, образование спор, стабильность плазмид, устойчивость к лекарственным препаратам, образование биопленки и вирулентность 18, 19 . Активность индола и его производных против других патогенных нематод не изучалась. В этом исследовании мы исследовали нематицидную активность 34 индолов против сосновых нематод и выяснили механизм действия наиболее сильного 5-йодоиндола с помощью микроскопии, покадровой фотографии и экспериментов по молекулярному докингу, а также оценили его токсическое воздействие на растения с помощью анализа прорастания семян.
Ранее сообщалось, что высокие концентрации (>1,0 мМ) индола оказывают нематицидное действие на нематод17. После обработки B. xylophilus (смешанные стадии жизни) индолом или 33 различными производными индола в концентрации 1 мМ смертность B. xylophilus измерялась путем подсчета живых и мертвых нематод в контрольной и обработанной группах. Пять индолов проявили значительную нематицидную активность; выживаемость необработанной контрольной группы составила 95 ± 7% через 24 часа. Из 34 протестированных индолов 5-йодоиндол и 4-фтороиндол в концентрации 1 мМ вызвали 100% смертность, тогда как 5,6-дифториндиго, метилиндол-7-карбоксилат и 7-йодоиндол вызвали приблизительно 50% смертность (таблица 1).
Влияние 5-йодоиндола на образование вакуолей и метаболизм сосновой нематоды. (A) Влияние авермектина и 5-йодоиндола на взрослых самцов нематод, (B) яйца нематод стадии L1 и (C) метаболизм B. xylophilus, (i) вакуоли не наблюдались в 0 ч, обработка привела к (ii) вакуолям, (iii) накоплению множественных вакуолей, (iv) набуханию вакуолей, (v) слиянию вакуолей и (vi) образованию гигантских вакуолей. Красные стрелки указывают на набухание вакуолей, синие стрелки указывают на слияние вакуолей, а черные стрелки указывают на гигантские вакуоли. Масштабная линейка = 50 мкм.
Кроме того, в этом исследовании также описан последовательный процесс смерти, вызванной метаном, у сосновых нематод (рисунок 4C). Метаногенная смерть — это неапоптотический тип смерти клеток, связанный с накоплением заметных цитоплазматических вакуолей27. Морфологические дефекты, наблюдаемые у сосновых нематод, по-видимому, тесно связаны с механизмом смерти, вызванной метаном. Микроскопическое исследование в разное время показало, что гигантские вакуоли образовались после 20 ч воздействия 5-йодоиндола (0,1 мМ). Микроскопические вакуоли были обнаружены после 8 ч обработки, и их количество увеличилось после 12 ч. Несколько крупных вакуолей были обнаружены после 14 ч. Несколько слившихся вакуолей были отчетливо видны после 12–16 ч обработки, что указывает на то, что слияние вакуолей является основой механизма метаногенной смерти. Через 20 часов несколько гигантских вакуолей были обнаружены по всему червю. Эти наблюдения представляют собой первое сообщение о метуозе у C. elegans.
У червей, обработанных 5-йодоиндолом, также наблюдались агрегация и разрыв вакуолей (рис. 5), о чем свидетельствует изгиб червя и высвобождение вакуолей в окружающую среду. Разрушение вакуолей также наблюдалось в мембране яичной скорлупы, которая обычно сохраняется нетронутой L2 во время вылупления (дополнительный рис. S2). Эти наблюдения подтверждают участие накопления жидкости и нарушения осморегуляции, а также обратимого повреждения клеток (RCI) в процессе образования вакуолей и нагноения (рис. 5).
Выдвигая гипотезу о роли йода в наблюдаемом образовании вакуолей, мы исследовали нематицидную активность йодида натрия (NaI) и йодида калия (KI). Однако в концентрациях (0,1, 0,5 или 1 мМ) они не влияли ни на выживаемость нематод, ни на образование вакуолей (Дополнительный рис. S5), хотя 1 мМ KI оказывал небольшое нематицидное действие. С другой стороны, 7-йодоиндол (1 или 2 мМ), как и 5-йодоиндол, вызывал множественные вакуоли и структурные деформации (Дополнительный рис. S6). Два йодоиндола показали схожие фенотипические характеристики у сосновых нематод, тогда как NaI и KI — нет. Интересно, что индол не вызывал образование вакуолей у B. xylophilus в исследованных концентрациях (данные не показаны). Таким образом, результаты подтвердили, что комплекс индола и йода отвечает за вакуолизацию и метаболизм B. xylophilus.
Среди индолов, протестированных на нематицидную активность, 5-йодоиндол имел самый высокий индекс скольжения -5,89 ккал/моль, за ним следуют 7-йодоиндол (-4,48 ккал/моль), 4-фтороиндол (-4,33) и индол (-4,03) ( Рисунок 6 ). Сильная водородная связь 5-йодоиндола с лейцином 218 стабилизирует его связывание, тогда как все другие производные индола связываются с серином 260 через водородные связи боковой цепи. Среди других смоделированных йодоиндолов 2-йодоиндол имеет связывающее значение -5,248 ккал/моль, что обусловлено его основной водородной связью с лейцином 218. Другие известные связывания включают 3-йодоиндол (-4,3 ккал/моль), 4-йодоиндол (-4,0 ккал/моль) и 6-фтороиндол (-2,6 ккал/моль) (дополнительный рисунок S8). Большинство галогенированных индолов и сам индол, за исключением 5-йодоиндола и 2-йодоиндола, образуют связь с серином 260. Тот факт, что водородная связь с лейцином 218 свидетельствует об эффективном связывании рецептора с лигандом, как это наблюдается для ивермектина (Дополнительный рис. S7), подтверждает, что 5-йодоиндол и 2-йодоиндол, как и ивермектин, прочно связываются с активным сайтом рецептора GluCL через лейцин 218 (рис. 6 и Дополнительный рис. S8). Мы предполагаем, что это связывание необходимо для поддержания открытой структуры пор комплекса GluCL и что, прочно связываясь с активным сайтом рецептора GluCL, 5-йодоиндол, 2-йодоиндол, авермектин и ивермектин таким образом поддерживают ионный канал открытым и позволяют поглощать жидкость.
Молекулярная стыковка индола и галогенированного индола с GluCL. Ориентации связывания лигандов (A) индола, (B) 4-фториндола, (C) 7-йодоиндола и (D) 5-йодоиндола с активным сайтом GluCL. Белок представлен лентой, а водородные связи основной цепи показаны желтыми пунктирными линиями. (A′), (B′), (C′) и (D′) показывают взаимодействия соответствующих лигандов с окружающими аминокислотными остатками, а водородные связи боковой цепи обозначены розовыми пунктирными стрелками.
Были проведены эксперименты по оценке токсического эффекта 5-йодоиндола на прорастание семян капусты и редиса. 5-йодоиндол (0,05 или 0,1 мМ) или авермектин (10 мкг/мл) оказали незначительное или нулевое влияние на начальное прорастание и появление ростков (рисунок 7). Кроме того, не было обнаружено существенной разницы между скоростью прорастания необработанных контролей и семян, обработанных 5-йодоиндолом или авермектином. Влияние на удлинение стержневого корня и количество образовавшихся боковых корней было незначительным, хотя 1 мМ (в 10 раз больше его активной концентрации) 5-йодоиндола немного задержал развитие боковых корней. Эти результаты показывают, что 5-йодоиндол нетоксичен для клеток растений и не мешает процессам развития растений в исследованных концентрациях.
Влияние 5-йодоиндола на прорастание семян. Прорастание, появление ростков и боковое укоренение семян B. oleracea и R. raphanistrum на агаровой среде Мурасиге и Скуга с авермектином или 5-йодоиндола или без них. Прорастание регистрировали через 3 дня инкубации при 22°C.
В этом исследовании сообщается о нескольких случаях уничтожения нематод индолами. Важно отметить, что это первый отчет о том, что йодоиндол вызывает метилирование (процесс, вызванный накоплением мелких вакуолей, которые постепенно сливаются в гигантские вакуоли, что в конечном итоге приводит к разрыву мембраны и смерти) в сосновых иголках, причем йодоиндол проявляет значительные нематицидные свойства, аналогичные свойствам коммерческого нематицида авермектина.
Ранее сообщалось, что индолы выполняют множество сигнальных функций в прокариотах и эукариотах, включая ингибирование/образование биопленки, выживание бактерий и патогенность19,32,33,34. В последнее время потенциальные терапевтические эффекты галогенированных индолов, индольных алкалоидов и полусинтетических производных индола привлекли широкий исследовательский интерес35,36,37. Например, было показано, что галогенированные индолы убивают устойчивые клетки Escherichia coli и Staphylococcus aureus37. Кроме того, представляет научный интерес изучение эффективности галогенированных индолов против других видов, родов и царств, и это исследование является шагом на пути к достижению этой цели.
Здесь мы предлагаем механизм летальности, вызванной 5-йодоиндолом у C. elegans, основанный на обратимом повреждении клеток (RCI) и метилировании (рисунки 4C и 5). Отечные изменения, такие как отечность и вакуолярная дегенерация, являются индикаторами RCI и метилирования, проявляющимися в виде гигантских вакуолей в цитоплазме48,49. RCI препятствует выработке энергии, снижая выработку АТФ, вызывая отказ насоса АТФазы или разрушая клеточные мембраны и вызывая быстрый приток Na+, Ca2+ и воды50,51,52. Внутрицитоплазматические вакуоли возникают в клетках животных в результате накопления жидкости в цитоплазме из-за притока Ca2+ и воды53. Интересно, что этот механизм повреждения клеток обратим, если повреждение временное и клетки начинают вырабатывать АТФ в течение определенного периода времени, но если повреждение сохраняется или ухудшается, клетки погибают.54 Наши наблюдения показывают, что нематоды, обработанные 5-йодоиндолом, не способны восстановить нормальный биосинтез после воздействия стрессовых условий.
Фенотип метилирования, вызванный 5-йодоиндолом в B. xylophilus, может быть обусловлен присутствием йода и его молекулярным распределением, поскольку 7-йодоиндол оказывал меньшее ингибирующее действие на B. xylophilus, чем 5-йодоиндол (таблица 1 и дополнительный рисунок S6). Эти результаты частично согласуются с исследованиями Maltese et al. (2014), которые сообщили, что транслокация пиридильного азотного фрагмента в индоле из пара- в мета-положение отменила вакуолизацию, ингибирование роста и цитотоксичность в клетках U251, что позволяет предположить, что взаимодействие молекулы с определенным активным сайтом в белке имеет решающее значение27,44,45. Взаимодействия между индолом или галогенированными индолами и рецепторами GluCL, наблюдаемые в этом исследовании, также подтверждают эту идею, поскольку было обнаружено, что 5- и 2-йодоиндол связываются с рецепторами GluCL сильнее, чем другие исследованные индолы (рисунок 6 и дополнительный рисунок S8). Было обнаружено, что йод во второй или пятой позиции индола связывается с лейцином 218 рецептора GluCL через водородные связи основной цепи, тогда как другие галогенированные индолы и сам индол образуют слабые водородные связи боковой цепи с серином 260 (рисунок 6). Поэтому мы предполагаем, что локализация галогена играет важную роль в индукции вакуолярной дегенерации, тогда как прочное связывание 5-йодоиндола сохраняет ионный канал открытым, тем самым обеспечивая быстрый приток жидкости и разрыв вакуоли. Однако подробный механизм действия 5-йодоиндола еще предстоит определить.
Перед практическим применением 5-йодоиндола необходимо проанализировать его токсическое действие на растения. Наши эксперименты по прорастанию семян показали, что 5-йодоиндол не оказывал отрицательного влияния на прорастание семян и последующие процессы развития в исследованных концентрациях (рисунок 7). Таким образом, данное исследование дает основание для использования 5-йодоиндола в экологической среде для контроля вредоносности сосновых нематод для сосны.
Предыдущие отчеты продемонстрировали, что терапия на основе индола представляет собой потенциальный подход к решению проблемы устойчивости к антибиотикам и прогрессирования рака55. Кроме того, индолы обладают антибактериальной, противораковой, антиоксидантной, противовоспалительной, противодиабетической, противовирусной, антипролиферативной и противотуберкулезной активностью и могут служить перспективной основой для разработки лекарств56,57. Это исследование впервые предполагает потенциальное использование йода в качестве противопаразитарного и противогельминтного средства.
Авермектин был открыт три десятилетия назад и получил Нобелевскую премию в 2015 году, и его использование в качестве антигельминтного средства все еще активно продолжается. Однако из-за быстрого развития устойчивости к авермектинам у нематод и насекомых-вредителей необходима альтернативная, недорогая и экологически чистая стратегия для контроля инфекции PWN у сосен. В этом исследовании также сообщается о механизме, с помощью которого 5-йодоиндол убивает сосновых нематод, и о том, что 5-йодоиндол имеет низкую токсичность для клеток растений, что открывает хорошие перспективы для его будущего коммерческого применения.
Все эксперименты были одобрены Комитетом по этике Университета Ённам, Кёнсан, Корея, а методы проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по этике Университета Ённам.
Эксперименты по инкубации яиц проводились с использованием установленных процедур43. Для оценки скорости вылупления (HR) однодневные взрослые нематоды (примерно 100 самок и 100 самцов) переносились в чашки Петри, содержащие грибок, и росли в течение 24 часов. Затем яйца изолировались и обрабатывались 5-йодоиндолом (0,05 мМ и 0,1 мМ) или авермектином (10 мкг/мл) в виде суспензии в стерильной дистиллированной воде. Эти суспензии (500 мкл; примерно 100 яиц) переносились в лунки 24-луночного планшета для культивирования тканей и инкубировались при температуре 22 °C. Подсчет L2 производился через 24 часа инкубации, но считались мертвыми, если клетки не двигались при стимуляции тонкой платиновой проволокой. Этот эксперимент проводился в два этапа, каждый с шестью повторениями. Данные обоих экспериментов были объединены и представлены. Процент ЧСС рассчитывается следующим образом:
Смертность личинок оценивали с помощью ранее разработанных процедур. Яйца нематод собирали, а эмбрионы синхронизировали путем вылупления в стерильной дистиллированной воде для получения личинок стадии L2. Синхронизированные личинки (примерно 500 нематод) обрабатывали 5-йодоиндолом (0,05 мМ и 0,1 мМ) или авермектином (10 мкг/мл) и выращивали на чашках Петри B. cinerea. Через 48 часов инкубации при 22 °C нематод собирали в стерильной дистиллированной воде и исследовали на наличие стадий L2, L3 и L4. Наличие стадий L3 и L4 указывало на личиночную трансформацию, тогда как наличие стадии L2 указывало на отсутствие трансформации. Изображения получали с помощью системы цифровой клеточной визуализации iRiS™. Этот эксперимент проводился в два этапа, каждый с шестью повторениями. Данные обоих экспериментов были объединены и представлены.
Токсичность 5-йодоиндола и авермектина для семян оценивали с помощью тестов на прорастание на пластинах агара Мурасиге и Скуга.62 Семена B. oleracea и R. raphanistrum сначала замачивали в стерильной дистиллированной воде в течение одного дня, промывали 1 мл 100% этанола, стерилизовали 1 мл 50% коммерческого отбеливателя (3% гипохлорита натрия) в течение 15 минут и промывали пять раз 1 мл стерильной воды. Затем стерилизованные семена прессовали на пластинах агара для проращивания, содержащих 0,86 г/л (0,2X) среды Мурасиге и Скуга и 0,7% бактериологического агара с 5-йодоиндола или авермектина или без них. Затем пластины инкубировали при температуре 22 °C, и снимки делали через 3 дня инкубации. Этот эксперимент проводился в два этапа, каждый из которых имел шесть повторений.
Время публикации: 26 февр. 2025 г.