Спасибо за посещение сайта Nature.com. Версия используемого вами браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для достижения наилучших результатов мы рекомендуем использовать более новую версию вашего браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В настоящее время, для обеспечения дальнейшей поддержки, мы отображаем сайт без стилей и JavaScript.
Открытие и полезное использование природных продуктов может способствовать улучшению жизни человека. Химические вещества, ингибирующие рост растений, широко используются в качестве гербицидов для борьбы с сорняками. В связи с необходимостью использования различных типов гербицидов возникает потребность в выявлении соединений с новыми механизмами действия. В данном исследовании мы обнаружили новое N-алкоксипиррольное соединение, кумамонамид, из Streptomyces werraensis MK493-CF1 и установили полный процесс его синтеза. С помощью биологических анализов мы обнаружили, что урс-моноамидная кислота является синтетическим промежуточным продуктом урс-моноамида и потенциальным...ингибитор роста растенийКроме того, мы разработали различные производные урбеноновой кислоты, включая урбенилоксипроизводное (UDA), обладающее высокой гербицидной активностью и не оказывающее негативного влияния на рост клеток HeLa. Мы также обнаружили, что производные урмотоновой кислоты разрушают микротрубочки растений; кроме того, KAND воздействует на актиновые филаменты и вызывает гибель клеток; эти многогранные эффекты отличаются от эффектов известных ингибиторов микротрубочек и предполагают новый механизм действия урсоновой кислоты, что представляет собой важное преимущество в разработке новых гербицидов.
Открытие и практическое применение полезных природных продуктов и их производных является средством улучшения качества жизни человека. Вторичные метаболиты, продуцируемые микроорганизмами, растениями и насекомыми, привели к значительным достижениям в медицине и сельском хозяйстве. Многие антибиотики и противолейкемические препараты были разработаны на основе природных продуктов. Кроме того, различные видыпестицидыИз этих природных продуктов извлекаются фунгициды и гербициды для использования в сельском хозяйстве. В частности, гербициды для борьбы с сорняками являются важными инструментами для повышения урожайности сельскохозяйственных культур в современном сельском хозяйстве, и различные типы соединений уже используются в коммерческих целях. Некоторые клеточные процессы в растениях, такие как фотосинтез, метаболизм аминокислот, синтез клеточной стенки, регуляция митоза, передача сигналов фитогормонов или синтез белка, считаются типичными мишенями гербицидов. Соединения, ингибирующие функцию микротрубочек, представляют собой распространенный класс гербицидов, которые влияют на рост растений, воздействуя на регуляцию митоза².
Микротрубочки являются компонентами цитоскелета и широко распространены в эукариотических клетках. Гетеродимер тубулина состоит из α-тубулина и β-тубулина, образующих линейные протофиламенты микротрубочек, причем 13 протофиламентов образуют цилиндрическую структуру. Микротрубочки играют множество ролей в растительных клетках, включая определение формы клетки, деление клеток и внутриклеточный транспорт3,4. Растительные клетки содержат микротрубочки под интерфазной плазматической мембраной, и считается, что эти так называемые кортикальные микротрубочки контролируют организацию целлюлозных микрофибрилл посредством регуляции комплексов целлюлозосинтазы4,5. Кортикальные микротрубочки эпидермальных клеток корня, присутствующие в зоне быстрого удлинения кончика корня, расположены латерально, и целлюлозные микрофибриллы следуют за этими микротрубочками, ограничивая направление расширения клетки и тем самым способствуя анизотропному удлинению клетки. Таким образом, функция микротрубочек тесно связана с морфологией растений. Замена аминокислот в генах, кодирующих тубулин, вызывает смещение корковых микротрубочковых структур и левосторонний или правосторонний рост у Arabidopsis 6,7. Аналогично, мутации в ассоциированных с микротрубочками белках, регулирующих динамику микротрубочек, также могут приводить к искаженному росту корней8,9,10,11,12,13. Кроме того, обработка гербицидами, разрушающими микротрубочки, такими как дизопирамид, также известный как претилахлор, также вызывает левосторонний косой рост корней14. Эти данные указывают на то, что точная регуляция функции микротрубочек имеет решающее значение для определения направления роста растений.
Были обнаружены различные типы ингибиторов микротрубочек, и эти препараты внесли значительный вклад в исследования цитоскелета, а также в сельское хозяйство и медицину². В частности, оризалин, соединения динитроанилина, дизопирамид, соединения, родственные бензамиду, и их аналоги могут ингибировать функцию микротрубочек и, следовательно, подавлять рост растений. Поэтому они широко используются в качестве гербицидов. Однако, поскольку микротрубочки являются важным компонентом растительных и животных клеток, большинство ингибиторов микротрубочек цитотоксичны для обоих типов клеток. Поэтому, несмотря на их признанную полезность в качестве гербицидов, в практических целях используется ограниченное количество антимикротрубочковых агентов.
Streptomyces — это род семейства Streptomyces, включающий аэробные, грамположительные, нитевидные бактерии, широко известные своей способностью продуцировать широкий спектр вторичных метаболитов. Поэтому он считается одним из важнейших источников новых биологически активных природных продуктов. В данном исследовании мы обнаружили новое соединение, называемое кумамонамидом, выделенное из Streptomyces werraensis MK493-CF1 и S. werraensis ISP 5486. С помощью спектрального анализа и полного спектрального анализа была охарактеризована структура кумамонамида и определен его уникальный N-алкоксипиррольный скелет. Было установлено, что урсмоновая кислота, синтетический промежуточный продукт урсмонамида и его производных, ингибирует рост и прорастание популярного модельного растения Arabidopsis thaliana. В исследовании зависимости структуры от активности мы обнаружили, что соединение с модификацией C9 до урсоновой кислоты, называемое нонилоксипроизводным урсоновой кислоты (KAND), значительно усиливает ингибирующее действие на рост и прорастание. Примечательно, что недавно обнаруженный ингибитор роста растений также влиял на рост табака и печеночника и не был цитотоксичен для бактерий или клеток HeLa. Более того, некоторые производные урмоновой кислоты вызывают искажение фенотипа корней, что подразумевает прямое или косвенное воздействие этих производных на микротрубочки. В соответствии с этой идеей, наши наблюдения за микротрубочками, помеченными иммуногистохимически или флуоресцентными белками, показывают, что обработка KAND деполимеризует микротрубочки. Кроме того, обработка производными кумамотоновой кислоты разрушала актиновые микрофиламенты. Таким образом, мы обнаружили новый ингибитор роста растений, уникальный механизм действия которого включает разрушение цитоскелета.
Штамм MK493-CF1 был выделен из почвы в районе Синагава-ку, Токио. Штамм MK493-CF1 образовывал хорошо разветвленный стромальный мицелий. Была определена частичная последовательность гена 16S рибосомальной РНК (1422 п.н.). Этот штамм очень похож на S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 п.н., T: типичный штамм, 99,93%). На основании этого результата было установлено, что этот штамм тесно связан с типовым штаммом S. werraensis. Поэтому мы предварительно назвали этот штамм S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T также продуцирует те же биологически активные соединения. Поскольку на ранних этапах исследований по получению природных продуктов из этого микроорганизма было проведено мало, были проведены дальнейшие химические исследования. После культивирования S. werraensis MK493-CF1 на ячменном субстрате методом твердофазной ферментации при 30°C в течение 14 дней, субстрат экстрагировали 50%-ным этанолом. 60 мл образца высушивали, получая 59,5 мг неочищенного экстракта. Неочищенный экстракт подвергали обращенно-фазовой ВЭЖХ, получая N-метокси-1H-пиррол-2-карбоксамид (1, названный кумамонамидом, 36,0 мг). Общее количество соединения 1 составляет приблизительно 60% от неочищенного экстракта. Поэтому мы решили подробно изучить свойства кумамонамида 1.
Кумамонамид 1 представляет собой белый аморфный порошок, и масс-спектрометрия высокого разрешения (HRESIMS) подтверждает его структуру как C6H8N2O2 (рис. 1). C2-замещенный пиррольный фрагмент этого соединения характеризуется δH 6,94 (1H, т, J = 2,8, 4,8 Гц, H-4), δH 6,78 (1H, д, J = 2,5, δH в спектре ЯМР 1H: 4,5 Гц, H-5) и δH 6,78 (1H, д, J = 2,5 Гц, H-6), а спектр ЯМР 13C показывает наличие четырех sp2-гибридизированных атомов углерода. Присутствие амидной группы в положении C2 было установлено по корреляции HMBC от протона C-3 к карбонильному атому углерода амидной группы при δC 161,1. Кроме того, пики в спектрах ЯМР 1H и 13C при δH 4,10 (3H, S) и δC 68,3 указывают на присутствие N-метоксигрупп в молекуле. Хотя правильное положение метоксигруппы еще не было определено с помощью спектроскопического анализа, такого как улучшенная дифференциальная спектроскопия и ядерная аббревиатура Оверхаузера (NOEDF), N-метокси-1H-пиррол-2-карбоксамид стал первым кандидатом на роль соединения.
Для определения правильной структуры соединения 1 был проведен полный синтез (рис. 2а). Обработка коммерчески доступного 2-аминопиридина 2 с помощью m-CPBA привела к образованию соответствующего N-оксида 3 с количественным выходом. После 2-аминоазидирования соединения 2 была проведена реакция циклоконденсации, описанная Абрамовичем, в бензоле при 90°C для получения желаемого 1-гидрокси-1H-пиррол-2-карбонитрила 5 в граммах. Скорость 60% (два этапа). 15,16. Метилирование и гидролиз соединения 4 затем дали 1-метокси-1H-пиррол-2-карбоновую кислоту (названную «кумотоновой кислотой», 6) с хорошим выходом (70%, два этапа). Наконец, амидирование через промежуточный хлорангидрид кислоты 6 с использованием водного раствора аммиака дало амид Кумамото 1 с выходом 98%. Все спектральные данные синтезированного соединения 1 были аналогичны данным изолированного соединения 1, поэтому структура соединения 1 была определена;
Общий синтез и анализ биологической активности урбенамида и урбеновой кислоты. (а) Полный синтез амида Кумамото. (б) Семидневные сеянцы дикого типа Arabidopsis Columbia (Col) выращивали на чашках Петри с питательной средой Мурасиге и Скога (MS), содержащей кумамонамид 6 или кумамонамид 1 в указанных концентрациях. Масштабная линейка = 1 см.
Сначала мы оценили биологическую активность урбенамида и его промежуточных продуктов на предмет их способности модулировать рост растений. Мы добавляли различные концентрации урсмонамида 1 или урсмоновой кислоты 6 в агаровую среду MS и культивировали на ней сеянцы Arabidopsis thaliana. Эти анализы показали, что высокие концентрации (500 мкМ) соединения 6 ингибируют рост корней (рис. 2b). Затем мы получили различные производные путем замещения N1 в соединении 6 и провели исследования зависимости структуры от активности (процесс синтеза аналогов описан в дополнительной информации (SI)). Сеянцы Arabidopsis выращивали на среде, содержащей 50 мкМ производных урсмоновой кислоты, и измеряли длину корней, как показано на рисунке. Как показано на рисунках 3a, b и S1, кумамокислоты имеют линейные алкоксильные цепи различной длины (9, 10, 11, 12 и 13) или более длинные алкоксильные цепи (15, 16 и 17) в положении N1. Производные показали значительное ингибирование роста корней. Кроме того, мы обнаружили, что применение 200 мкМ 10, 11 или 17 ингибирует прорастание (рис. 3c и S2).
Исследование зависимости структуры от активности амида Кумамото и родственных соединений. (а) Структура и схема синтеза аналогов. (б) Количественная оценка длины корней 7-дневных сеянцев, выращенных на среде MS с добавлением или без добавления 50 мкМ производных кумамонамида. Звездочками отмечены существенные различия по сравнению с контрольной группой (t-критерий, p < 0,05).< 0,05). n>18. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. nt означает «не тестировалось», поскольку более 50% семян не проросли. (c) Количественная оценка скорости прорастания обработанных семян, инкубированных в течение 7 дней в среде MS с добавлением или без добавления 200 мкМ кумамонамида и родственных соединений. Звездочками отмечены значимые различия по сравнению с контрольной обработкой (критерий хи-квадрат). n=96.
Интересно, что добавление алкильных боковых цепей длиннее C9 снижало ингибирующую активность, что позволяет предположить, что соединения, родственные кумамотиновой кислоте, требуют боковых цепей определенного размера для проявления своей биологической активности.
Поскольку анализ зависимости структуры от активности показал, что C9 был модифицирован до урсоновой кислоты, а нонилоксипроизводное урсоновой кислоты (далее именуемое KAND 11) являлось наиболее эффективным ингибитором роста растений, мы провели более детальную характеристику KAND 11. Обработка Arabidopsis 50 мкМ KAND 11 почти полностью предотвращала прорастание, тогда как более низкие концентрации (40, 30, 20 или 10 мкМ) KAND 11 ингибировали рост корней дозозависимым образом (рис. 4a, b). Чтобы проверить, влияет ли KAND 11 на жизнеспособность корневых меристем, мы исследовали корневые меристемы, окрашенные пропидиум йодидом (PI), и измеряли площадь меристемы. Размер меристемы сеянцев, выращенных на среде, содержащей 25 мкМ KAND-11, составлял 151,1 ± 32,5 мкм, тогда как размер меристемы сеянцев, выращенных на контрольной среде, содержащей DMSO, составлял 264,7 ± 30,8 мкм (рис. 4c, d), что указывает на то, что KAND-11 восстанавливает клеточную активность. Распространение. Корневая меристема. В соответствии с этим, обработка KAND-11 снизила количество сигнала маркера клеточного деления CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS в корневой меристеме (рис. 4e) 17. Эти результаты указывают на то, что KAND-11 ингибирует рост корней, снижая активность пролиферации клеток.
Анализ ингибирующего действия производных урбеноновой кислоты (урбенилоксипроизводных) на рост. (а) 7-дневные сеянцы дикого типа Col, выращенные на чашках Петри с питательной средой MS с указанными концентрациями KAND 11. Масштабная линейка = 1 см. (б) Количественная оценка длины корней. Буквы указывают на существенные различия (критерий Тьюки HSD, p < 0,05).< 0,05). n>16. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. (c) Конфокальная микроскопия корней дикого типа Col, окрашенных пропидиум йодидом, выращенных на чашках Петри с питательной средой MS с добавлением или без добавления 25 мкМ KAND 11. Белые скобки обозначают меристему корня. Масштабная линейка = 100 мкм. (d) Количественная оценка размера меристемы корня (n = 10–11). Статистические различия определялись с помощью t-критерия (p < 0,05).< 0,05). Столбики представляют средний размер меристемы. (e) Дифференциально-интерференционная контрастная микроскопия (ДИК) корневой меристемы, содержащей конструкцию CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS, окрашенная и окрашенная на 5-дневных сеянцах, выращенных на чашках Петри с питательной средой MS с или без анализа 25 мкМ KAND.
Фитотоксичность KAND 11 была дополнительно протестирована с использованием другого двудольного растения, табака (Nicotiana tabacum), и основного модельного организма наземных растений, печеночника (Marchantia polymorpha). Как и в случае с арабидопсисом, сеянцы табака SR-1, выращенные на среде, содержащей 25 мкМ KAND 11, образовали более короткие корни (рис. 5а). Кроме того, 40 из 48 семян проросли на чашках Петри, содержащих 200 мкМ KAND 11, тогда как все 48 семян проросли на контрольной среде, что указывает на значимость более высоких концентраций KAND (p < 0,05).< 0,05; критерий хи-квадрат) ингибировал прорастание табака (рис. 5b). Кроме того, концентрация KAND 11, ингибирующая рост бактерий в печеночнике, была аналогична эффективной концентрации в арабидопсисе (рис. 5c). Эти результаты показывают, что KAND 11 может ингибировать рост различных растений. Затем мы исследовали возможную цитотоксичность соединений, родственных медвежьему моноамиду, в других организмах, а именно в клетках HeLa человека и штамме Escherichia coli DH5α, как представителях клеток высших животных и бактерий соответственно. В серии анализов пролиферации клеток мы наблюдали, что кумамонамид 1, кумамонамидная кислота 6 и KAND 11 не влияли на рост клеток HeLa или E. coli при концентрации 100 мкМ (рис. 5d,e).
Ингибирование роста KAND 11 в организмах, не относящихся к Arabidopsis. (a) Двухнедельные сеянцы табака дикого типа SR-1 выращивали на вертикально расположенных чашках Петри с питательной средой MS, содержащей 25 мкМ KAND 11. (b) Двухнедельные сеянцы табака дикого типа SR-1 выращивали на горизонтально расположенных чашках Петри с питательной средой MS, содержащей 200 мкМ KAND 11. (c) Двухнедельные почки печеночника дикого типа Tak-1 выращивали на чашках Петри с питательной средой Gamborg B5 с указанными концентрациями KAND 11. Красные стрелки указывают на споры, рост которых прекратился в течение двухнедельного инкубационного периода. (d) Анализ пролиферации клеток HeLa. Количество жизнеспособных клеток измеряли через фиксированные интервалы времени с помощью набора для подсчета клеток 8 (Dojindo). В качестве контроля клетки HeLa обрабатывали 5 мкг/мл актиномицина D (Act D), который ингибирует транскрипцию РНК-полимеразы и вызывает гибель клеток. Анализы проводили в трех повторениях. (e) Анализ пролиферации клеток E. coli. Рост E. coli анализировали путем измерения оптической плотности при 600 нм (OD600). В качестве контроля клетки обрабатывали 50 мкг/мл ампициллина (Amp), который ингибирует синтез клеточной стенки бактерий. Анализы проводили в трех повторениях.
Для расшифровки механизма действия цитотоксичности, вызванной соединениями, родственными урамиду, мы повторно проанализировали производные урбеновой кислоты с умеренным ингибирующим действием, как показано на рисунке. Как показано на рисунках 2b, 6a, у сеянцев, выращенных на агаровых пластинах, содержащих высокие концентрации (200 мкМ) урмотоновой кислоты 6, корни были короче и изогнуты влево (θ = – 23,7 ± 6,1), тогда как у сеянцев, выращенных на контрольной среде, корни были почти прямыми (θ = – 3,8 ± 7,1). Известно, что такой характерный косой рост является результатом дисфункции кортикальных микротрубочек14,18. В соответствии с этим выводом, препараты, дестабилизирующие микротрубочки, дизопирамид и оризалин, вызывали аналогичное наклонение корней в наших условиях выращивания (рис. 2b, 6a). Одновременно мы протестировали производные урмотоновой кислоты и выбрали несколько из них, которые при определенных концентрациях вызывали косой рост корней. Соединения 8, 9 и 15 изменяли направление роста корней при концентрациях 75 мкМ, 50 мкМ и 40 мкМ соответственно, что указывает на то, что эти соединения могут эффективно дестабилизировать микротрубочки (рис. 2b, 6a). Мы также протестировали наиболее сильнодействующее производное урсоловой кислоты, KAND 11, при более низкой концентрации (15 мкМ) и обнаружили, что применение KAND 11 ингибирует рост корней, и направление роста корней было неравномерным, хотя они имели тенденцию к наклону влево (рис. C3). Поскольку более высокие концентрации препаратов, дестабилизирующих микротрубочки, иногда ингибируют рост растений, а не вызывают наклон корней, мы впоследствии оценили возможность того, что KAND 11 влияет на микротрубочки, наблюдая кортикальные микротрубочки в эпидермальных клетках корня. Иммуногистохимическое исследование с использованием антител к β-тубулину в эпидермальных клетках корней проростков, обработанных 25 мкМ KAND 11, показало исчезновение почти всех кортикальных микротрубочек в эпидермальных клетках в зоне удлинения (рис. 6b). Эти результаты указывают на то, что кумамотоновая кислота и ее производные действуют прямо или косвенно на микротрубочки, разрушая их, и что эти соединения являются новыми ингибиторами микротрубочек.
Урсоновая кислота и ее производные изменяют кортикальные микротрубочки у Arabidopsis thaliana. (а) Угол наклона корня, измеренный в присутствии различных производных урмононовой кислоты в указанных концентрациях. Также были проанализированы эффекты двух соединений, известных как ингибиторы микротрубочек: дизопирамида и оризалина. На вставке показан стандарт, используемый для измерения угла роста корня. Звездочками отмечены значимые различия по сравнению с контрольной обработкой (t-критерий, p < 0,05).< 0,05). n>19. Масштабная линейка = 1 см. (b) Кортикальные микротрубочки в эпидермальных клетках в зоне удлинения. Микротрубочки в корнях дикого типа Arabidopsis Col, выращенных на чашках Петри с питательной средой MS с добавлением или без добавления 25 мкМ KAND 11, визуализировали с помощью иммуногистохимического окрашивания с использованием первичных антител к β-тубулину и вторичных антител, конъюгированных с Alexa Fluor. Масштабная линейка = 10 мкм. (c) Митотическая структура микротрубочек в корневой меристеме. Микротрубочки визуализировали с помощью иммуногистохимического окрашивания. Митотические структуры, включая зоны профазы, веретена деления и фрагмопласты, подсчитывали по конфокальным изображениям. Стрелками указаны митотические структуры микротрубочек. Звездочками отмечены значимые различия по сравнению с контрольной группой (t-критерий, p < 0,05).< 0,05). n>9. Масштабная линейка = 50 мкм.
Хотя Ursa обладает способностью нарушать функцию микротрубочек, ожидается, что механизм его действия будет отличаться от типичных агентов, деполимеризующих микротрубочки. Например, более высокие концентрации агентов, деполимеризующих микротрубочки, таких как дизопирамид и оризалин, вызывают анизотропное расширение эпидермальных клеток, тогда как KAND 11 этого не делает. Кроме того, совместное применение KAND 11 и дизопирамида привело к комбинированному эффекту дизопирамида, вызывающему рост корней, и ингибированию роста, вызванному KAND 11 (рис. S4). Мы также проанализировали реакцию гиперчувствительного мутанта дизопирамида 1-1 (phs1-1) на KAND 11. phs1-1 имеет неканоническую точечную мутацию тубулинкиназы и образует более короткие корни при обработке дизопирамидом9,20. У мутантных сеянцев phs1-1, выращенных на агаровой среде, содержащей KAND 11, корни были короче, как и у сеянцев, выращенных на дисопирамидной среде (рис. S5).
Кроме того, в корневой меристеме проростков, обработанных KAND 11, мы наблюдали структуры митотических микротрубочек, такие как зоны профазы, веретена деления и фрагмопласты. В соответствии с наблюдениями для CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, было отмечено значительное уменьшение числа митотических микротрубочек (рис. 6c).
Для характеристики цитотоксичности KAND 11 на субклеточном уровне мы обработали суспензионные клетки табака BY-2 препаратом KAND 11 и наблюдали за их реакцией. Сначала мы добавили KAND 11 к клеткам BY-2, экспрессирующим TagRFP-TUA6, который флуоресцентно метит микротрубочки, чтобы оценить влияние KAND 11 на кортикальные микротрубочки. Плотность кортикальных микротрубочек оценивали с помощью анализа изображений, который количественно определял процент цитоскелетных пикселей среди цитоплазматических пикселей. Результаты анализа показали, что после обработки 50 мкМ или 100 мкМ KAND 11 в течение 1 часа плотность значительно снизилась до 0,94 ± 0,74% или 0,23 ± 0,28% соответственно, в то время как плотность клеток, обработанных ДМСО, составила 1,61 ± 0,34% (рис. 7а). Эти результаты согласуются с наблюдением на Arabidopsis, что обработка KAND 11 вызывает деполимеризацию кортикальных микротрубочек (рис. 6b). Мы также исследовали линию BY-2 с актиновыми филаментами, меченными GFP-ABD, после обработки той же концентрацией KAND 11 и обнаружили, что обработка KAND 11 разрушает актиновые филаменты. Обработка 50 мкМ или 100 мкМ KAND 11 в течение 1 часа значительно снизила плотность актиновых филаментов до 1,20 ± 0,62% или 0,61 ± 0,26% соответственно, тогда как плотность в клетках, обработанных DMSO, составляла 1,69 ± 0,51% (рис. 2). 7b). Эти результаты контрастируют с эффектами пропизамида, который не влияет на актиновые филаменты, и латрункулина B, деполимеризатора актина, который не влияет на микротрубочки (дополнительный рисунок S6). Кроме того, обработка кумамонамидом 1, кумамонамидной кислотой 6 или KAND 11 не влияла на микротрубочки в клетках HeLa (дополнительный рисунок S7). Таким образом, механизм действия KAND 11, как полагают, отличается от механизма действия известных разрушителей цитоскелета. Кроме того, наше микроскопическое наблюдение за клетками BY-2, обработанными KAND 11, выявило начало клеточной смерти во время обработки KAND 11 и показало, что доля мертвых клеток, окрашенных синим Эванса, не увеличивалась значительно после 30 минут обработки KAND 11, тогда как после 90 минут обработки 50 мкМ или 100 мкМ KAND количество мертвых клеток увеличилось до 43,7% или 80,1% соответственно (рис. 7c). В совокупности эти данные указывают на то, что новое производное урсоловой кислоты KAND 11 является специфическим для растений ингибитором цитоскелета с ранее неизвестным механизмом действия.
KAND влияет на кортикальные микротрубочки, актиновые филаменты и жизнеспособность клеток табака BY-2. (а) Визуализация кортикальных микротрубочек в клетках BY-2 в присутствии TagRFP-TUA6. Клетки BY-2, обработанные KAND 11 (50 мкМ или 100 мкМ) или ДМСО, исследовали с помощью конфокальной микроскопии. Плотность кортикальных микротрубочек рассчитывали по микрофотографиям 25 независимых клеток. Буквы указывают на значимые различия (критерий Тьюки HSD, p < 0,05).(b) Кортикальные актиновые филаменты в клетках BY-2, визуализированные в присутствии GFP-ABD2. Клетки BY-2, обработанные KAND 11 (50 мкМ или 100 мкМ) или DMSO, исследовали с помощью конфокальной микроскопии. Плотность кортикальных актиновых филаментов рассчитывали по микрофотографиям 25 независимых клеток. Буквы указывают на значимые различия (критерий Тьюки HSD, p < 0,05).< 0,05). Масштабная линейка = 10 мкм. (c) Наблюдение мертвых клеток BY-2 с помощью окрашивания Эванса синим. Клетки BY-2, обработанные KAND 11 (50 мкМ или 100 мкМ) или ДМСО, исследовали с помощью световой микроскопии. n=3. Масштабная линейка = 100 мкм.
Открытие и применение новых природных соединений привело к значительным достижениям в различных аспектах человеческой жизни, включая медицину и сельское хозяйство. Исторически проводились исследования с целью получения полезных соединений из природных ресурсов. В частности, актиномицеты известны своей эффективностью в качестве противопаразитарных антибиотиков против нематод благодаря их способности продуцировать различные вторичные метаболиты, такие как авермектин, ведущее соединение ивермектина, и блеомицин и его производные, используемые в медицине в качестве противоракового средства21,22. Аналогичным образом, из актиномицетов было обнаружено множество гербицидных соединений, некоторые из которых уже используются в коммерческих целях1,23. Поэтому анализ метаболитов актиномицетов для выделения природных соединений с желаемой биологической активностью считается эффективной стратегией. В данном исследовании мы обнаружили новое соединение, кумамонамид, из S. werraensis и успешно синтезировали его. Урсоновая кислота является синтетическим промежуточным продуктом урбенамида и его производных. Урмотоновая кислота может вызывать характерное скручивание корней, проявлять умеренную или сильную гербицидную активность и прямо или косвенно повреждать микротрубочки растений. Однако механизм действия урмотоновой кислоты может отличаться от механизма действия существующих ингибиторов микротрубочек, поскольку KAND 11 также разрушает актиновые филаменты и вызывает гибель клеток, что предполагает наличие регуляторного механизма, посредством которого урмотоновая кислота и ее производные влияют на широкий спектр цитоскелетных структур.
Дальнейшая детальная характеристика урбеноновой кислоты поможет лучше понять механизм ее действия. В частности, следующая задача — оценить способность урсоновой кислоты связываться с восстановленными микротрубочками, чтобы определить, действуют ли урсоновая кислота и ее производные непосредственно на микротрубочки и деполимеризуют их, или же их действие приводит к дестабилизации микротрубочек. Кроме того, в случае, когда микротрубочки не являются прямой мишенью, определение места действия и молекулярных мишеней урсоновой кислоты на растительных клетках поможет лучше понять свойства родственных соединений и возможные способы повышения гербицидной активности. Наш анализ биологической активности выявил уникальную цитотоксическую способность урсоновой кислоты в отношении роста таких растений, как Arabidopsis thaliana, табак и печеночник, в то время как клетки E. coli и HeLa не подвергались воздействию. Низкая или нулевая токсичность для клеток животных является преимуществом производных урсоновой кислоты, если они разрабатываются в качестве гербицидов для использования на открытых сельскохозяйственных полях. Действительно, поскольку микротрубочки являются распространенными структурами в эукариотах, их избирательное ингибирование в растениях является ключевым требованием для гербицидов. Например, пропизамид, агент, деполимеризующий микротрубочки, который непосредственно связывается с тубулином и ингибирует полимеризацию, используется в качестве гербицида благодаря своей низкой токсичности для клеток животных24. В отличие от дизопирамида, родственные бензамиды имеют другую целевую специфичность. Помимо растительных микротрубочек, RH-4032 или бензоксамид также ингибируют микротрубочки клеток животных или оомицетов соответственно, а залиламид используется в качестве фунгицида благодаря своей низкой фитотоксичности25,26,27. Недавно обнаруженный медведь и его производные проявляют избирательную цитотоксичность по отношению к растениям, но стоит отметить, что дальнейшие модификации могут изменить их целевую специфичность, потенциально предоставляя дополнительные производные для борьбы с патогенными грибами или оомицетами.
Уникальные свойства урбеноновой кислоты и ее производных полезны для их разработки в качестве гербицидов и использования в качестве исследовательских инструментов. Важность цитоскелета в контроле формы растительных клеток широко признана. Более ранние исследования показали, что растения выработали сложные механизмы организации кортикальных микротрубочек, контролируя динамику микротрубочек для надлежащего управления морфогенезом. Было идентифицировано большое количество молекул, ответственных за регуляцию активности микротрубочек, и соответствующие исследования все еще продолжаются3,4,28. Наше современное понимание динамики микротрубочек в растительных клетках не полностью объясняет механизмы организации кортикальных микротрубочек. Например, хотя как дизопирамид, так и оризалин могут деполимеризовать микротрубочки, дизопирамид вызывает сильную деформацию корней, в то время как оризалин оказывает относительно мягкое воздействие. Более того, мутации в тубулине, который стабилизирует микротрубочки, также вызывают правостороннюю ротацию в корнях, тогда как паклитаксел, который также стабилизирует динамику микротрубочек, этого не делает. Таким образом, изучение и идентификация молекулярных мишеней урсоловой кислоты должны дать новые представления о регуляции микротрубочек коры растений. Аналогично, будущие сравнения химических веществ, эффективно стимулирующих деформированный рост, таких как дизопирамид, и менее эффективных веществ, таких как оризалин или кумамоторовая кислота, дадут подсказки о том, как происходит деформированный рост.
С другой стороны, перестройки цитоскелета, связанные с защитными механизмами, являются еще одной возможной причиной цитотоксичности урсоновой кислоты. Инфекция патогеном или введение элиситора в растительные клетки иногда вызывают разрушение цитоскелета и последующую гибель клеток29. Например, сообщалось, что криптоксантин, полученный из оомицетов, разрушает микротрубочки и актиновые филаменты до гибели клеток табака, подобно тому, что происходит при обработке KAND30,31. Сходство между защитными реакциями и клеточными реакциями, индуцированными урсоновой кислотой, привело нас к гипотезе о том, что они запускают общие клеточные процессы, хотя очевидно более быстрое и сильное действие урсоновой кислоты, чем криптоксантина. Однако исследования показали, что разрушение актиновых филаментов способствует спонтанной гибели клеток, которая не всегда сопровождается разрушением микротрубочек29. Кроме того, остается неясным, вызывает ли патоген или элиситор искаженный рост корней, как это делают производные урсоновой кислоты. Таким образом, молекулярные знания, связывающие защитные реакции и цитоскелет, представляют собой привлекательную задачу для решения. Использование низкомолекулярных соединений, родственных урсоновой кислоте, а также ряда производных с различной эффективностью, может открыть возможности для воздействия на неизвестные клеточные механизмы.
В совокупности открытие и применение новых соединений, модулирующих динамику микротрубочек, обеспечат мощные методы для изучения сложных молекулярных механизмов, лежащих в основе определения формы растительных клеток. В этом контексте недавно разработанное соединение урмотоновая кислота, воздействующая на микротрубочки и актиновые филаменты и вызывающая гибель клеток, может предоставить возможность расшифровать связь между контролем микротрубочек и этими другими механизмами. Таким образом, химический и биологический анализ с использованием урбеноновой кислоты поможет нам понять молекулярные регуляторные механизмы, контролирующие растительный цитоскелет.
В колбу Эрленмейера объемом 500 мл с перегородками внесли инокулят S. werraensis MK493-CF1, содержащую 110 мл питательной среды, состоящей из 2% (вес/объем) галактозы, 2% (вес/объем) пасты Essence, 1% (вес/объем) Bacto composition -соевого раствора (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (вес/объем) кукурузного экстракта (KOGOSTCH Co., Ltd., Япония), 0,2% (вес/объем) (NH4)2SO4 и 0,2% CaCO3 в деионизированной воде (pH 7,4 перед стерилизацией). Культуры инкубировали на роторном шейкере (180 об/мин) при 27°C в течение 2 дней. Производство осуществлялось методом твердофазной ферментации. Посевную культуру (7 мл) перенесли в колбу К-1 объемом 500 мл, содержащую 40 г питательной среды, состоящей из 15 г прессованного ячменя (MUSO Co., Ltd., Япония) и 25 г деионизированной воды (pH не корректировали перед стерилизацией). Ферментацию проводили при 30°C в темноте в течение 14 дней. Ферментационный материал экстрагировали 40 мл/бутылку этанола и центрифугировали (1500 g, 4°C, 10 мин). Надосадочную жидкость культуры (60 мл) экстрагировали смесью 10% метанола и этилацетата. Органический слой выпаривали под пониженным давлением для получения остатка (59,5 мг), который подвергали ВЭЖХ с градиентным элюированием (0–10 мин: 90%) на обращенно-фазовой колонке (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 мкм, внутренний диаметр 10 мм × длина 250 мм) H2O/CH3CN, 10–35 мин: 90% H2O/CH3CN до 70% H2O/CH3CN (градиент), 35–45 мин: 90% H2O/EtOH, 45–155 мин: 90% H2O/EtOH до 100% EtOH (градиент, 155–200 мин: 100% EtOH) при скорости потока 1,5 мл/мин, в результате чего был выделен кумамонамид (1, 36,0 мг) в виде белого аморфного порошка.
Кумамотоамид(1); 1H-ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ 6.93 (т, J = 2.5 Гц, 1H), 6.76 (дд, J = 4.3, 1.8 Гц 1H), 6.05 (т, J = 3.8 Гц, 1H), 4.08 (с, 3H); 13C-ЯМР (125 МГц, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ расчетное значение: 141,0659, измеренное значение: 141,0663, ИК νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 см–1.
Семена сорта Columbia (Col-0) были получены из Центра биологических ресурсов арабидопсиса (ABRC) с разрешения на использование в исследовательских целях. Семена Col-0 размножались и поддерживались в условиях нашей лаборатории и использовались в качестве растений арабидопсиса дикого типа. Семена арабидопсиса были стерилизованы на поверхности и культивировались в среде Мурасиге и Скога половинной концентрации, содержащей 2% сахарозы (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (вес/объем) 2-(4-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) и 1,5% агара (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, при температуре 23 °C и постоянном освещении. Семена мутанта phs1-1 были предоставлены Т. Хашимото (Нарский институт науки и технологий).
Семена штамма SR-1 были предоставлены Т. Хашимото (Нарский институт науки и технологий) и использованы в качестве дикорастущих растений табака. Семена табака были поверхностно стерилизованы и замочены в стерильной воде на три ночи для стимуляции прорастания, затем помещены в раствор половинной концентрации, содержащий 2% сахарозы, 0,05% (вес/объем) MES и 0,8% геллановой камеди (Fujifilm Wako Pure Chemical) на среде Мурасиге и Скуга с pH 5,7 и инкубированы при 23°C при постоянном освещении.
Штамм Tak-1 был предоставлен Т. Кохчи (Киотский университет) и использовался в качестве стандартной экспериментальной единицы для исследования печеночников. Культуру Gemma получали из стерилизованных растений, затем высевали на среду Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical), содержащую 1% сахарозы и 0,3% геллановой камеди, и инкубировали при 23°C при непрерывном освещении.
Клетки табака BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) были предоставлены С. Хасезавой (Токийский университет). Клетки BY-2 были разведены в 95 раз в модифицированной среде Линсмейера и Скога и еженедельно дополнялись 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой³². Клеточную суспензию перемешивали на роторном шейкере при 130 об/мин при 27°C в темноте. Клетки промывали в 10 раз большим объемом свежей среды и ресуспендировали в той же среде. Трансгенные клеточные линии BY-2, стабильно экспрессирующие маркер микротрубочек TagRFP-TUA6 или маркер актиновых филаментов GFP-ABD2 под контролем промотора 35S вируса мозаики цветной капусты, были получены, как описано ранее³³,³⁴,³⁵. Эти клеточные линии можно поддерживать и синхронизировать с помощью процедур, аналогичных тем, которые использовались для исходной клеточной линии BY-2.
Клетки HeLa культивировали в модифицированной среде Дульбекко (DMEM) (Life Technologies), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, 1,2 Ед/мл пенициллина и 1,2 мкг/мл стрептомицина, в инкубаторе при 37°C с 5% CO2.
Все эксперименты, описанные в данной рукописи, проводились в соответствии с японскими правилами и рекомендациями по биобезопасности.
Соединения растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО; Fujifilm Wako Pure Chemical) в виде исходных растворов и разбавляли в среде MS для арабидопсиса и табака или в среде Gamborg B5 для печеночника. Для анализа ингибирования роста корней более 10 семян на чашку Петри высевали на агаровую среду, содержащую указанные соединения или ДМСО. Семена инкубировали в камере для выращивания растений в течение 7 дней. Сеянцы фотографировали и измеряли длину корней. Для анализа прорастания арабидопсиса 48 семян на чашку Петри высевали на агаровую среду, содержащую 200 мкМ соединения или ДМСО. Семена арабидопсиса выращивали в камере для выращивания растений, и количество проросших сеянцев подсчитывали через 7 дней после прорастания (дд). Для анализа прорастания табака 24 семени на чашку Петри высевали на агаровую среду, содержащую 200 мкМ KAND или ДМСО. Семена табака выращивали в камере для выращивания растений, и количество проросших сеянцев подсчитывали через 14 дней. Для анализа ингибирования роста печеночников 9 эмбрионов с каждой чашки Петри высевали на агаровую среду, содержащую указанные концентрации KAND или DMSO, и инкубировали в камере для выращивания растений в течение 14 дней.
Для визуализации организации корневой меристемы использовали проростки, окрашенные 5 мг/мл пропидиум йодидом (ПИ). Сигналы ПИ наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе TCS SPE (Leica Microsystems).
Гистохимическое окрашивание корней β-глюкуронидазой (GUS) проводили согласно протоколу, описанному Малами и Бенфеем36. Сеянцы фиксировали в 90% ацетоне в течение ночи, окрашивали 0,5 мг/мл 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-d-глюкуроновой кислотой в GUS-буфере в течение 1 часа и помещали в гидратированный раствор хлоральдегида (8 г хлоралгидрата, 2 мл воды и 1 мл глицерина) и наблюдали с помощью дифференциально-интерференционной контрастной микроскопии на микроскопе Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Углы наклона корней измеряли у 7-дневных сеянцев, выращенных на вертикально расположенных пластинах. Измеряйте угол наклона корня относительно направления вектора гравитации, как описано в шаге 6.
Расположение кортикальных микротрубочек наблюдалось, как описано, с небольшими изменениями в протоколе 37. В качестве первичных и вторичных антител использовались антитела к β-тубулину (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) и конъюгированные с Alexa Fluor 488 антитела к мышиному IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) в разведениях 1:1000 и 1:100 соответственно. Флуоресцентные изображения были получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа TCS SPE (Leica Microsystems). Получение изображений Z-стека и создание проекций максимальной интенсивности осуществлялись в соответствии с инструкциями производителя.
Анализ пролиферации клеток HeLa проводился с использованием набора для подсчета клеток Cell Counting Kit 8 (Dojindo) в соответствии с инструкциями производителя.
Рост E. coli DH5α анализировали путем измерения плотности клеток в культуре с использованием спектрофотометра при длине волны 600 нм (OD600).
Организация цитоскелета в трансгенных клетках BY-2 наблюдалась с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного конфокальным сканирующим устройством CSU-X1 (Yokogawa) и sCMOS-камерой (Zyla, Andor Technology). Плотность цитоскелета оценивалась с помощью анализа изображений, который количественно определял процент цитоскелетных пикселей среди цитоплазматических пикселей на конфокальных изображениях с использованием программного обеспечения ImageJ, как описано в работах 38 и 39.
Для обнаружения гибели клеток BY-2 аликвоту клеточной суспензии инкубировали с 0,05% раствором Эванса синего в течение 10 минут при комнатной температуре. Селективное окрашивание мертвых клеток красителем Эванса синего зависит от выведения красителя из жизнеспособных клеток неповрежденной плазматической мембраной40. Окрашенные клетки наблюдали с помощью светового микроскопа (BX53, Olympus).
Клетки HeLa выращивали в среде DMEM с добавлением 10% FBS во влажном инкубаторе при 37°C и 5% CO2. Клетки обрабатывали 100 мкМ KAND 11, кумамонаминовой кислотой 6, кумамонамидом 1, 100 нг/мл колцемида (Gibco) или 100 нг/мл Нокодмаза (Sigma) в течение 6 ч при 37°C. Клетки фиксировали метанолом в течение 10 мин, а затем ацетатом в течение 5 мин при комнатной температуре. Фиксированные клетки инкубировали с первичными антителами к β-тубулину (1D4A4, Proteintech: 66240-1), разведенными в 0,5% BSA/PBS, в течение 2 ч, промывали 3 раза TBST, а затем инкубировали с козьими антителами Alexa Fluor. 488 1 ч. – Мышиный IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) и 15 нг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), разведенные в 0,5% BSA/PBS. После трехкратного промывания раствором TBST окрашенные клетки наблюдали на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse Ti-E. Изображения получали с помощью охлаждаемой ПЗС-камеры Hamamatsu ORCA-R2, используя программное обеспечение MetaMorph (Molecular Devices).
Дата публикации: 17 июня 2024 г.