Благодарим вас за посещение Nature.com. Используемая вами версия браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для достижения наилучших результатов рекомендуем использовать более новую версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В настоящее время, для обеспечения постоянной поддержки, мы отображаем сайт без стилей и JavaScript.
Открытие и эффективное использование природных продуктов может способствовать улучшению жизни человека. Ингибиторы роста растений широко используются в качестве гербицидов для борьбы с сорняками. В связи с необходимостью использования различных типов гербицидов существует необходимость в выявлении соединений с новыми механизмами действия. В данном исследовании мы обнаружили новое соединение N-алкоксипиррола, кумамонамид, из Streptomyces werraensis MK493-CF1 и установили полный процесс его синтеза. С помощью анализа биологической активности мы обнаружили, что урс-моноамидовая кислота является промежуточным продуктом синтеза урс-моноамида и потенциальным...ингибитор роста растенийКроме того, мы разработали различные производные урбеноновой кислоты, включая урбенилоксипроизводное (UDA), обладающее высокой гербицидной активностью, не оказывая негативного влияния на рост клеток HeLa. Мы также обнаружили, что производные урмотоновой кислоты разрушают микротрубочки растений; кроме того, KAND воздействует на актиновые филаменты и вызывает гибель клеток. Эти многогранные эффекты отличаются от эффектов известных ингибиторов микротрубочек и предполагают новый механизм действия урсоновой кислоты, что представляет собой важное преимущество при разработке новых гербицидов.
Открытие и практическое применение полезных природных продуктов и их производных – это способ улучшить качество жизни человека. Вторичные метаболиты, продуцируемые микроорганизмами, растениями и насекомыми, привели к значительному прогрессу в медицине и сельском хозяйстве. Многие антибиотики и противолейкозные препараты были разработаны на основе природных продуктов. Кроме того, различные видыпестицидыИз этих природных продуктов извлекаются фунгициды и гербициды для использования в сельском хозяйстве. В частности, гербициды для борьбы с сорняками являются важными инструментами повышения урожайности в современном сельском хозяйстве, и различные типы соединений уже используются в коммерческих целях. Некоторые клеточные процессы в растениях, такие как фотосинтез, метаболизм аминокислот, синтез клеточной стенки, регуляция митоза, сигнализация фитогормонов и синтез белка, считаются типичными мишенями для гербицидов. Соединения, ингибирующие функцию микротрубочек, представляют собой распространённый класс гербицидов, влияющих на рост растений путём воздействия на регуляцию митоза2.
Микротрубочки являются компонентами цитоскелета и широко распространены в эукариотических клетках. Гетеродимер тубулина состоит из α-тубулина и β-тубулина, образующих линейные протофиламенты микротрубочек, при этом 13 протофиламентов формируют цилиндрическую структуру. Микротрубочки играют множество ролей в растительных клетках, включая определение формы клетки, клеточное деление и внутриклеточный транспорт3,4. Растительные клетки содержат микротрубочки под интерфазной плазматической мембраной, и считается, что эти так называемые кортикальные микротрубочки контролируют организацию целлюлозных микрофибрилл посредством регуляции комплексов целлюлозосинтазы4,5. Кортикальные микротрубочки эпидермальных клеток корня, присутствующие в зоне быстрого удлинения кончика корня, расположены латерально, и целлюлозные микроволокна следуют за этими микротрубочками и ограничивают направление расширения клетки, тем самым способствуя анизотропному удлинению клетки. Таким образом, функция микротрубочек тесно связана с морфологией растения. Аминокислотные замены в генах, кодирующих тубулин, вызывают перекос кортикальных микротрубочек и лево- или правосторонний рост у Arabidopsis6,7. Аналогичным образом, мутации в белках, ассоциированных с микротрубочками и регулирующих их динамику, также могут приводить к искажению роста корней8,9,10,11,12,13. Кроме того, обработка гербицидами, разрушающими микротрубочки, такими как дизопирамид, также известный как претилахлор, также вызывает левосторонний наклон корней14. Эти данные свидетельствуют о том, что точная регуляция функции микротрубочек критически важна для определения направления роста растения.
Были открыты различные типы ингибиторов микротрубочек, и эти препараты внесли значительный вклад в исследования цитоскелета, а также в сельское хозяйство и медицину2. В частности, оризалин, динитроанилиновые соединения, дизопирамид, бензамидные соединения и их аналоги могут ингибировать функцию микротрубочек и, таким образом, подавлять рост растений. Поэтому они широко используются в качестве гербицидов. Однако, поскольку микротрубочки являются важным компонентом растительных и животных клеток, большинство ингибиторов микротрубочек цитотоксичны для обоих типов клеток. Поэтому, несмотря на их признанную эффективность в качестве гербицидов, ограниченное число антимикротрубочковых агентов используется в практических целях.
Streptomyces — род семейства Streptomyces, включающего аэробные грамположительные нитчатые бактерии, широко известный своей способностью продуцировать широкий спектр вторичных метаболитов. Поэтому он считается одним из важнейших источников новых биологически активных природных продуктов. В текущем исследовании мы обнаружили новое соединение, называемое кумамонамидом, которое было выделено из Streptomyces werraensis MK493-CF1 и S. werraensis ISP 5486. С помощью спектрального анализа и полного спектрального анализа была охарактеризована структура кумамонамида и определен его уникальный N-алкоксипиррольный скелет. синтез. Было обнаружено, что урсмоновая кислота, синтетический промежуточный продукт урсмоноамида и его производных, ингибирует рост и прорастание популярного модельного растения Arabidopsis thaliana. В исследовании взаимосвязи структуры и активности мы обнаружили, что соединение с C9-модифицированным до урсоновой кислоты, называемое нонилоксипроизводным урсоновой кислоты (KAND), значительно усиливает ингибирующее действие на рост и прорастание. Примечательно, что недавно открытый ингибитор роста растений также повлиял на рост табака и печеночника и не был цитотоксичным для бактерий или клеток HeLa. Более того, некоторые производные урмотоновой кислоты вызывают искажение фенотипа корней, что указывает на то, что эти производные напрямую или косвенно влияют на микротрубочки. В соответствии с этой идеей наши наблюдения за микротрубочками, мечеными иммуногистохимически или флуоресцентными белками, указывают на то, что обработка KAND деполимеризует микротрубочки. Кроме того, обработка производными кумамотоновой кислоты разрушала актиновые микрофиламенты. Таким образом, мы обнаружили новый ингибитор роста растений, уникальный механизм действия которого включает разрушение цитоскелета.
Штамм MK493-CF1 был выделен из почвы в Shinagawa-ku, Tokyo. Штамм MK493-CF1 образовал хорошо разветвленный стромальный мицелий. Была определена частичная последовательность гена рибосомной РНК 16S (1422 п.н.). Этот штамм очень похож на S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 п.н., T: типичный штамм, 99,93%). На основании этого результата было определено, что этот штамм близкородственен типовому штамму S. werraensis. Поэтому мы временно назвали этот штамм S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T также продуцирует те же биологически активные соединения. Поскольку на раннем этапе было мало исследований по получению природных продуктов из этого микроорганизма, были проведены дополнительные химические исследования. После культивирования S. werraensis MK493-CF1 на ячменной среде методом твердофазной ферментации при температуре 30°C в течение 14 дней, среду экстрагировали 50% этанолом. 60 мл образца высушили, получив 59,5 мг неочищенного экстракта. Полученный неочищенный экстракт подвергли обращенно-фазовой ВЭЖХ для получения N-метокси-1H-пиррол-2-карбоксамида (1, названного кумамонамидом, 36,0 мг). Общее количество 1 составляет приблизительно 60% от неочищенного экстракта. Поэтому мы решили подробно изучить свойства кумамотоамида 1.
Кумамонамид 1 представляет собой белый аморфный порошок, и масс-спектрометрия высокого разрешения (HRESIMS) подтверждает принадлежность к C6H8N2O2 (рис. 1). C2-замещенный пиррольный фрагмент этого соединения характеризуется δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Гц, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH в спектре ЯМР 1H: 4,5 Гц, H-5) и δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Гц, H-6), а спектр ЯМР 13C показывает наличие четырёх атомов углерода sp2. Наличие амидной группы в положении C2 было оценено с помощью корреляции HMBC от протона C-3 к углероду амидной карбониловой группы при δC 161,1. Кроме того, пики ЯМР 1 H и 13 C при δH 4,10 (3H, S) и δC 68,3 указывают на наличие N-метоксигрупп в молекуле. Хотя точное положение метоксигруппы ещё не было определено с помощью спектроскопического анализа, такого как усиленная дифференциальная спектроскопия и ядерная аббревиатура Оверхаузера (NOEDF), N-метокси-1H-пиррол-2-карбоксамид стал первым соединением-кандидатом.
Для определения правильной структуры 1 был выполнен полный синтез (рис. 2а). Обработка коммерчески доступного 2-аминопиридина 2 m-CPBA привела к получению соответствующего N-оксида 3 с количественным выходом. После 2-аминоазидирования 2 была проведена реакция циклоконденсации, описанная Абрамовичем, в бензоле при 90 °C для получения желаемого 1-гидрокси-1H-пиррол-2-карбонитрила 5 в граммах. Скорость 60% (две стадии). 15,16. Затем метилирование и гидролиз 4 дали 1-метокси-1H-пиррол-2-карбоновую кислоту (называемую «кумотоновой кислотой», 6) с хорошим выходом (70%, две стадии). Наконец, амидирование через промежуточный хлорангидрид кислоты 6 с использованием водного раствора аммиака дало амид Кумамото 1 с выходом 98%. Все спектральные данные синтезированного 1 были аналогичны выделенному 1, поэтому была определена структура 1;
Общий синтез и анализ биологической активности урбенамида и урбеновой кислоты. (a) Полный синтез амида Кумамото. (b) Семидневные проростки Arabidopsis Columbia (Col) дикого типа выращивали на чашках Петри Мурасиге и Скуга (MS), содержащих кумамонамид 6 или кумамонамид 1 в указанных концентрациях. Масштабная линейка = 1 см.
Во-первых, мы оценили биологическую активность урбенамида и его промежуточных продуктов на предмет их способности модулировать рост растений. Мы добавляли различные концентрации урсмонамида 1 или урсмоновой кислоты 6 в агаризованную среду MS и культивировали проростки Arabidopsis thaliana на этой среде. Результаты показали, что высокие концентрации (500 мкМ) урсмонамида 6 ингибируют рост корней (рис. 2b). Затем мы получили различные производные, заменяя положение N1 урсмонамида 6, и провели на них исследования взаимосвязи структуры и активности (процесс синтеза аналогов описан в разделе «Дополнительная информация» (SI)). Проростки Arabidopsis выращивали на среде, содержащей 50 мкМ производных урсоновой кислоты, и измеряли длину корней, как показано на рисунке. Как показано на рисунках 3a, b и S1, кумамокислоты имеют различную длину линейных алкоксицепей (9, 10, 11, 12 и 13) или длинных алкоксицепей (15, 16 и 17) в положении N1. Производные показали значительное ингибирование роста корней. Кроме того, мы обнаружили, что применение 200 мкМ 10, 11 или 17 подавляло прорастание (рис. 3c и S2).
Исследование взаимосвязи структуры и активности амида Кумамото и родственных соединений. (a) Структура и схема синтеза аналогов. (b) Количественная оценка длины корней 7-дневных проростков, выращенных на среде MS с добавлением или без добавления 50 мкМ производных кумамонамида. Звездочки обозначают значимые различия при ложной обработке (t-критерий, p< 0,05). н>18. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. nt означает «не тестировалось», поскольку более 50% семян не проросли. (c) Количественная оценка скорости прорастания обработанных семян, инкубированных в течение 7 дней в среде MS с добавлением 200 мкМ кумамонамида и родственных соединений или без них. Звездочки обозначают значимые различия с ложной обработкой (критерий хи-квадрат). n=96.
Интересно, что добавление алкильных боковых цепей длиннее C9 снижало ингибирующую активность, что позволяет предположить, что соединениям, родственным кумамотоовой кислоте, требуются боковые цепи определенного размера для проявления их биологической активности.
Поскольку анализ взаимосвязи структуры и активности показал, что C9 был модифицирован до урсоновой кислоты, а нонилоксипроизводное урсоновой кислоты (далее именуемое KAND 11) оказалось наиболее эффективным ингибитором роста растений, мы провели более детальное исследование KAND 11. Обработка Arabidopsis 50 мкМ KAND 11 практически полностью предотвратила прорастание, тогда как более низкие концентрации (40, 30, 20 или 10 мкМ) KAND 11 ингибировали рост корней дозозависимым образом (рис. 4a, b). Чтобы проверить, влияет ли KAND 11 на жизнеспособность корневых меристем, мы исследовали корневые меристемы, окрашенные йодидом пропидия (PI), и измеряли площадь меристем. Размер меристемы сеянцев, выращенных на среде, содержащей 25 мкМ KAND-11, составил 151,1 ± 32,5 мкм, тогда как размер меристемы сеянцев, выращенных на контрольной среде, содержащей ДМСО, составил 264,7 ± 30,8 мкм (рис. 4c, d), что указывает на то, что KAND-11 восстанавливает клеточную активность. распространение. Корневая меристема. В соответствии с этим, обработка KAND 11 снизила количество сигнала маркера клеточного деления CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS в корневой меристеме (рис. 4e) 17 . Эти результаты указывают на то, что KAND 11 ингибирует рост корня за счет снижения активности пролиферации клеток.
Анализ ингибирующего действия производных урбеноновой кислоты (урбенилоксипроизводных) на рост. (a) Семидневные проростки дикого типа Col, выращенные на чашках Петри с указанными концентрациями KAND 11. Масштабная линейка = 1 см. (b) Количественная оценка длины корней. Буквы обозначают значимые различия (тест Тьюки HSD, p< 0,05). н>16. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение (SD). (c) Конфокальная микроскопия корней дикого типа Col, окрашенных йодидом пропидия, выращенных на чашках MS с добавлением 25 мкМ KAND 11 или без него. Белые скобки обозначают корневую меристему. Масштабная линейка = 100 мкм. (d) Количественная оценка размера корневой меристемы (n = 10–11). Статистические различия определяли с помощью t-критерия Стьюдента (p< 0,05). Столбцы представляют средний размер меристемы. (e) Дифференциально-интерференционная контрастная микроскопия (ДИК) корневой меристемы, содержащей конструкцию CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS, окрашенная и окрашенная на 5-дневных сеянцах, выращенных на чашках MS с анализом 25 мкМ KAND или без него.
Фитотоксичность KAND 11 была дополнительно исследована с использованием другого двудольного растения, табака (Nicotiana tabacum), и одного из основных модельных организмов наземных растений, печеночника (Marchantia polymorpha). Как и в случае с Arabidopsis, проростки табака SR-1, выращенные на среде, содержащей 25 мкМ KAND 11, давали более короткие корни (рис. 5а). Кроме того, 40 из 48 семян проросли на чашках с 200 мкМ KAND 11, тогда как все 48 семян проросли на контрольной среде, что указывает на значительное повышение концентрации KAND (p< 0,05; хи-квадрат) ингибировал прорастание табака. (Рис. 5b). Кроме того, концентрация KAND 11, которая ингибировала рост бактерий в печеночнике, была аналогична эффективной концентрации в Arabidopsis (Рис. 5c). Эти результаты указывают на то, что KAND 11 может ингибировать рост различных растений. Затем мы исследовали возможную цитотоксичность соединений, родственных моноамиду медведя, в других организмах, а именно в клетках человека HeLa и штамме Escherichia coli DH5α, как представителей высших животных и бактериальных клеток, соответственно. В серии анализов пролиферации клеток мы наблюдали, что кумамонамид 1, кумамонамидовая кислота 6 и KAND 11 не влияли на рост клеток HeLa или E. coli в концентрациях 100 мкМ (Рис. 5d,e).
Ингибирование роста KAND 11 в организмах, не относящихся к Arabidopsis. (a) Двухнедельные сеянцы табака дикого типа SR-1 выращивали на вертикально расположенных чашках MS, содержащих 25 мкМ KAND 11. (b) Двухнедельные сеянцы табака дикого типа SR-1 выращивали на горизонтально расположенных чашках MS, содержащих 200 мкМ KAND 11. (c) Двухнедельные почки печеночника дикого типа Tak-1, выращенные на чашках Gamborg B5 с указанными концентрациями KAND 11. Красные стрелки указывают на споры, которые прекратили рост в течение двухнедельного периода инкубации. (d) Анализ пролиферации клеток HeLa. Количество жизнеспособных клеток измеряли через фиксированные промежутки времени с помощью набора для подсчета клеток 8 (Dojindo). В качестве контроля клетки HeLa обрабатывали актиномицином D (Act D) в концентрации 5 мкг/мл, который ингибирует транскрипцию РНК-полимеразы и вызывает гибель клеток. Анализы проводили в трёх повторах. (e) Анализ пролиферации клеток E. coli. Рост E. coli анализировали путём измерения оптической плотности (OD600). В качестве контроля клетки обрабатывали ампициллином (Amp) в концентрации 50 мкг/мл, который ингибирует синтез клеточной стенки бактерий. Анализы проводили в трёх повторах.
Чтобы расшифровать механизм действия цитотоксичности, вызванной соединениями, родственными урамидам, мы повторно проанализировали производные урбеновой кислоты с умеренным ингибирующим эффектом, как показано на рисунке. Как показано на рисунках 2b, 6a, сеянцы, выращенные на агаровых пластинах, содержащих высокие концентрации (200 мкМ) урмотоновой кислоты 6, образовывали более короткие и изогнутые влево корни (θ = –23,7 ± 6,1), тогда как сеянцы, выращенные на контрольной среде, образовывали почти прямые корни (θ = –3,8 ± 7,1). Известно, что этот характерный наклонный рост является результатом дисфункции кортикальных микротрубочек14,18. В соответствии с этим выводом, препараты, дестабилизирующие микротрубочки, дизопирамид и оризалин, вызывали схожий наклон корней в наших условиях роста (рис. 2b, 6a). В то же время мы протестировали производные урмотоновой кислоты и выбрали несколько из них, которые при определенных концентрациях индуцировали наклонный рост корней. Соединения 8, 9 и 15 изменяли направление роста корней при 75 мкМ, 50 мкМ и 40 мкМ соответственно, что указывает на то, что эти соединения могут эффективно дестабилизировать микротрубочки (рис. 2b, 6a). Мы также протестировали наиболее мощное производное урсоловой кислоты, KAND 11, в более низкой концентрации (15 мкМ) и обнаружили, что применение KAND 11 ингибировало рост корней, и что направление роста корней было неравномерным, хотя они имели тенденцию к наклону влево (рисунок C3). . Поскольку более высокие концентрации препаратов, дестабилизирующих микротрубочки, иногда ингибируют рост растений, а не вызывают наклон корней, мы впоследствии оценили возможность того, что KAND 11 влияет на микротрубочки, наблюдая за кортикальными микротрубочками в эпидермальных клетках корней. Иммуногистохимическое исследование с использованием антител к β-тубулину в эпидермальных клетках корней проростков, обработанных 25 мкМ KAND 11, показало исчезновение практически всех кортикальных микротрубочек в эпидермальных клетках зоны растяжения (рис. 6b). Эти результаты свидетельствуют о том, что кумамотоновая кислота и её производные действуют непосредственно или опосредованно на микротрубочки, разрушая их, и что эти соединения являются новыми ингибиторами микротрубочек.
Урсоновая кислота и её производные изменяют кортикальные микротрубочки Arabidopsis thaliana. (a) Угол наклона корня, измеренный в присутствии различных производных урмотоновой кислоты в указанных концентрациях. Также было проанализировано действие двух соединений, известных как ингибирующие микротрубочки: дизопирамида и оризалина. На врезке показан стандарт, используемый для измерения угла роста корня. Звёздочки обозначают значимые различия при ложной обработке (t-критерий, p< 0,05). н>19. Масштабная линейка: 1 см. (b) Кортикальные микротрубочки в эпидермальных клетках зоны растяжения. Микротрубочки в корнях Arabidopsis Col дикого типа, выращенных на чашках MS с добавлением 25 мкМ KAND 11 или без него, визуализировали иммуногистохимическим окрашиванием с использованием первичных антител к β-тубулину и вторичных антител, конъюгированных с Alexa Fluor. Масштабная линейка: 10 мкм. (c) Митотическая структура микротрубочек в корневой меристеме. Микротрубочки визуализировали с помощью иммуногистохимического окрашивания. Митотические структуры, включая профазы, веретена деления и фрагмопласты, подсчитывали на конфокальных изображениях. Стрелки указывают на структуру митотических микротрубочек. Звездочки указывают на значимые различия при ложной обработке (t-критерий, p< 0,05). н>9. Масштабная линейка = 50 мкм.
Хотя Ursa способен нарушать функцию микротрубочек, ожидается, что механизм его действия будет отличаться от механизма действия типичных агентов, деполимеризующих микротрубочки. Например, более высокие концентрации агентов, деполимеризующих микротрубочки, таких как дизопирамид и оризалин, вызывают анизотропное расширение эпидермальных клеток, тогда как KAND 11 этого не делает. Кроме того, совместное применение KAND 11 и дизопирамида приводило к комбинированному росту корней, индуцированному дизопирамидом, и к ингибированию роста, индуцированному KAND 11 (рис. S4). Мы также проанализировали реакцию гиперчувствительного мутанта дизопирамида 1-1 (phs1-1) на KAND 11. phs1-1 имеет неканоническую точечную мутацию тубулинкиназы и приводит к образованию более коротких корней при обработке дизопирамидом9,20. У сеянцев мутанта phs1-1, выращенных на агаризованной среде, содержащей KAND 11, были более короткие корни, похожие на корни, выращенные на дизопирамиде (рис. S5).
Кроме того, мы наблюдали структуры митотических микротрубочек, такие как профазные зоны, веретена и фрагмопласты, в корневой меристеме сеянцев, обработанных KAND 11. В соответствии с наблюдениями для CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, наблюдалось значительное уменьшение количества митотических микротрубочек (рис. 6c).
Чтобы охарактеризовать цитотоксичность KAND 11 на субклеточном уровне, мы обработали суспензионные клетки табака BY-2 KAND 11 и наблюдали за их ответом. Сначала мы добавили KAND 11 к клеткам BY-2, экспрессирующим TagRFP-TUA6, который флуоресцентно маркирует микротрубочки, чтобы оценить влияние KAND 11 на кортикальные микротрубочки. Плотность кортикальных микротрубочек оценивали с помощью анализа изображений, который количественно определял процент пикселей цитоскелета среди цитоплазматических пикселей. Результаты анализа показали, что после обработки 50 мкМ или 100 мкМ KAND 11 в течение 1 часа плотность значительно снизилась до 0,94 ± 0,74% или 0,23 ± 0,28% соответственно, в то время как плотность клеток, обработанных ДМСО, составила 1,61 ± 0,34% (рис. 7а). Эти результаты согласуются с данными, полученными для Arabidopsis, согласно которым обработка KAND 11 вызывает деполимеризацию кортикальных микротрубочек (рис. 6b). Мы также исследовали линию BY-2 с актиновыми филаментами, меченными GFP-ABD, после обработки KAND 11 в той же концентрации и обнаружили, что обработка KAND 11 разрушает актиновые филаменты. Обработка KAND 11 в концентрации 50 мкМ или 100 мкМ в течение 1 ч значительно снижала плотность актиновых филаментов до 1,20 ± 0,62% и 0,61 ± 0,26% соответственно, тогда как в клетках, обработанных ДМСО, плотность составляла 1,69 ± 0,51% (рис. 2). 7b). Эти результаты контрастируют с эффектами пропизамида, который не влияет на актиновые филаменты, и латрункулина B, деполимеризатора актина, который не влияет на микротрубочки (SI Рисунок S6). Кроме того, обработка кумамонамидом 1, кумамонамидной кислотой 6 или KAND 11 не влияла на микротрубочки в клетках HeLa (SI Рисунок S7). Таким образом, считается, что механизм действия KAND 11 отличается от механизма действия известных разрушителей цитоскелета. Кроме того, наше микроскопическое наблюдение за клетками BY-2, обработанными KAND 11, выявило начало гибели клеток во время обработки KAND 11 и показало, что доля мертвых клеток, окрашенных синим Эванса, существенно не увеличилась после 30 минут обработки KAND 11, тогда как после 90 минут обработки 50 мкМ или 100 мкМ KAND количество мертвых клеток увеличилось до 43,7% и 80,1% соответственно (рис. 7c). В совокупности эти данные указывают на то, что новое производное урсоловой кислоты KAND 11 является ингибитором цитоскелета, специфичным для растений, с ранее неизвестным механизмом действия.
KAND влияет на кортикальные микротрубочки, актиновые филаменты и жизнеспособность клеток табака BY-2. (a) Визуализация кортикальных микротрубочек в клетках BY-2 в присутствии TagRFP-TUA6. Клетки BY-2, обработанные KAND 11 (50 мкМ или 100 мкМ) или ДМСО, исследовали с помощью конфокальной микроскопии. Плотность кортикальных микротрубочек рассчитывали по микрофотографиям 25 независимых клеток. Буквы обозначают значимые различия (тест Тьюки HSD, p< 0,05). Масштабная линейка = 10 мкм. (b) Кортикальные актиновые филаменты в клетках BY-2, визуализированные в присутствии GFP-ABD2. Клетки BY-2, обработанные KAND 11 (50 мкМ или 100 мкМ) или ДМСО, исследовали с помощью конфокальной микроскопии. Плотность кортикальных актиновых филаментов рассчитывали по микрофотографиям 25 независимых клеток. Буквы обозначают значимые различия (тест Тьюки HSD, p< 0,05). Масштабная линейка = 10 мкм. (c) Наблюдение за мертвыми клетками BY-2 с помощью окрашивания синим Эвансом. Клетки BY-2, обработанные KAND 11 (50 мкМ или 100 мкМ) или ДМСО, исследовали методом светлопольной микроскопии. n = 3. Масштабная линейка = 100 мкм.
Открытие и применение новых природных продуктов привело к значительному прогрессу в различных аспектах жизни человека, включая медицину и сельское хозяйство. Исторические исследования были проведены для получения полезных соединений из природных ресурсов. В частности, известно, что актиномицеты полезны в качестве противопаразитарных антибиотиков для нематод благодаря своей способности продуцировать различные вторичные метаболиты, такие как авермектин, основное соединение ивермектина и блеомицина, и его производные, используемые в медицине в качестве противоракового средства21,22. Аналогичным образом, у актиномицетов был обнаружен ряд гербицидных соединений, некоторые из которых уже используются в коммерческих целях1,23. Поэтому анализ метаболитов актиномицетов для выделения природных продуктов с желаемой биологической активностью считается эффективной стратегией. В данном исследовании мы обнаружили новое соединение, кумамонамид, из S. werraensis и успешно синтезировали его. Урсоновая кислота является синтетическим промежуточным продуктом урбенамида и его производных. Он может вызывать характерное скручивание корней, проявлять гербицидную активность от умеренной до сильной и напрямую или косвенно повреждать микротрубочки растений. Однако механизм действия урмотоновой кислоты может отличаться от механизма действия существующих ингибиторов микротрубочек, поскольку KAND 11 также разрушает актиновые филаменты и вызывает гибель клеток, что указывает на регуляторный механизм, посредством которого урмотоновая кислота и её производные влияют на широкий спектр структур цитоскелета.
Дальнейшее детальное изучение урбеноновой кислоты поможет лучше понять механизм её действия. В частности, следующей целью является оценка способности урбеноновой кислоты связываться с восстановленными микротрубочками, чтобы определить, действуют ли урсоновая кислота и её производные непосредственно на микротрубочки и деполимеризуют их, или же их действие приводит к дестабилизации микротрубочек. Кроме того, в случае, когда микротрубочки не являются прямой мишенью, определение места действия и молекулярных мишеней урсоновой кислоты в растительных клетках поможет глубже понять свойства родственных соединений и возможные пути повышения гербицидной активности. Наш анализ биоактивности выявил уникальную цитотоксическую способность урсоновой кислоты влиять на рост таких растений, как Arabidopsis thaliana, табак и печёночный мох, при этом клетки E. coli и HeLa не были затронуты. Низкая или нулевая токсичность для животных клеток является преимуществом производных урсоновой кислоты при их разработке в качестве гербицидов для использования на открытых сельскохозяйственных полях. Действительно, поскольку микротрубочки являются распространёнными структурами у эукариот, их селективное ингибирование в растениях является ключевым требованием для гербицидов. Например, пропизамид, деполимеризующий агент микротрубочек, который напрямую связывается с тубулином и ингибирует полимеризацию, используется в качестве гербицида благодаря своей низкой токсичности для животных клеток24. В отличие от дизопирамида, родственные бензамиды имеют иную целевую специфичность. Помимо растительных микротрубочек, RH-4032 или бензоксамид также ингибируют микротрубочки животных клеток или оомицетов, соответственно, а залиламид используется в качестве фунгицида благодаря своей низкой фитотоксичности25,26,27. Недавно обнаруженный мед и его производные проявляют селективную цитотоксичность в отношении растений, но стоит отметить, что дальнейшие модификации могут изменить их целевую специфичность, потенциально обеспечивая дополнительные производные для контроля патогенных грибов или оомицетов.
Уникальные свойства урбеноновой кислоты и её производных полезны для их разработки в качестве гербицидов и использования в качестве исследовательских инструментов. Важность цитоскелета в контроле формы растительных клеток широко признана. Более ранние исследования показали, что растения выработали сложные механизмы организации кортикальных микротрубочек, контролируя их динамику для надлежащего управления морфогенезом. Было идентифицировано большое количество молекул, ответственных за регуляцию активности микротрубочек, и соответствующие исследования всё ещё продолжаются3,4,28. Наше современное понимание динамики микротрубочек в растительных клетках не полностью объясняет механизмы организации кортикальных микротрубочек. Например, хотя и дизопирамид, и оризалин могут деполимеризовать микротрубочки, дизопирамид вызывает серьёзную деформацию корней, в то время как оризалин оказывает относительно слабое действие. Более того, мутации в тубулине, стабилизирующем микротрубочки, также вызывают правовращательное движение корней, тогда как паклитаксел, также стабилизирующий динамику микротрубочек, не вызывает этого. Таким образом, изучение и идентификация молекулярных мишеней урсоловой кислоты должны дать новое представление о регуляции кортикальных микротрубочек растений. Аналогичным образом, будущее сравнение химических веществ, эффективно стимулирующих нарушения роста, таких как дизопирамид, и менее эффективных, таких как оризалин или кумамоторная кислота, позволит понять, как происходит нарушение роста.
С другой стороны, перестройки цитоскелета, связанные с защитными механизмами, являются ещё одним возможным объяснением цитотоксичности урсоновой кислоты. Инфицирование патогеном или введение элиситора в растительные клетки иногда приводит к разрушению цитоскелета и последующей гибели клеток29. Например, сообщалось, что криптоксантин, полученный из оомицетов, разрушает микротрубочки и актиновые филаменты до гибели клеток табака, подобно тому, что происходит при обработке KAND30,31. Сходство между защитными реакциями и клеточными реакциями, вызванными урсоновой кислотой, позволило нам предположить, что они запускают общие клеточные процессы, хотя очевидно более быстрое и сильное действие урсоновой кислоты, чем криптоксантина. Однако исследования показали, что разрушение актиновых филаментов способствует спонтанной гибели клеток, которая не всегда сопровождается разрушением микротрубочек29. Кроме того, ещё предстоит выяснить, вызывает ли патоген или элиситор нарушение роста корней, как это делают производные урсоновой кислоты. Таким образом, изучение молекулярных взаимосвязей защитных реакций и цитоскелета представляет собой привлекательную задачу. Использование низкомолекулярных соединений, родственных урсоновой кислоте, а также ряда её производных с различной активностью может открыть возможности для воздействия на неизвестные клеточные механизмы.
В совокупности открытие и применение новых соединений, модулирующих динамику микротрубочек, позволит разработать эффективные методы исследования сложных молекулярных механизмов, лежащих в основе определения формы растительных клеток. В этом контексте недавно разработанное соединение урбеноновая кислота, которое воздействует на микротрубочки и актиновые филаменты и вызывает гибель клеток, может дать возможность расшифровать связь между контролем микротрубочек и этими другими механизмами. Таким образом, химический и биологический анализ с использованием урбеноновой кислоты поможет нам понять молекулярные регуляторные механизмы, контролирующие цитоскелет растений.
Инокулируйте S. werraensis MK493-CF1 в колбу Эрленмейера объёмом 500 мл с перегородкой, содержащую 110 мл посевной среды, состоящей из 2% (вес/объём) галактозы, 2% (вес/объём) пасты-эссенции, 1% (вес/объём) бакто-композиции - сойтона (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (вес/объём) кукурузного экстракта (KOGOSTCH Co., Ltd., Япония), 0,2% (вес/объём) (NH4)2SO4 и 0,2% CaCO3 в деионизированной воде (pH 7,4 перед стерилизацией). Посевные культуры инкубировали на роторной качалке (180 об/мин) при температуре 27 °C в течение 2 дней. Производственное культивирование методом твёрдофазной ферментации. Посевную культуру (7 мл) переносили в колбу К-1 объёмом 500 мл, содержащую 40 г питательной среды, состоящей из 15 г прессованного ячменя (MUSO Co., Ltd., Япония) и 25 г деионизированной воды (pH перед стерилизацией не корректировали). Ферментацию проводили при температуре 30°C в темноте в течение 14 дней. Ферментированный материал экстрагировали этанолом (40 мл/бутылку) и центрифугировали (1500 g, 4°C, 10 мин). Культуральный супернатант (60 мл) экстрагировали смесью 10% метанола/этилацетата. Органический слой упаривали при пониженном давлении с получением остатка (59,5 мг), который подвергали ВЭЖХ с градиентным элюированием (0–10 минут: 90%) на колонке с обращенной фазой (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 мкм, ID 10 мм × длина 250 мм) H2O/CH3CN, 10–35 минут: 90% H2O/CH3CN до 70% H2O/CH3CN (градиент), 35–45 минут: 90% H2O/EtOH, 45–155 минут: 90% H2O/EtOH до 100% EtOH (градиент (градиент), 155–200 мин: 100% EtOH) при скорости потока 1,5 мл/мин, кумамонамид (1, 36,0 мг) выделяли в виде белого аморфного порошка.
Кумамотоамид(1); 1H-ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Гц, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Гц 1H), 6,05 (t , J = 3,8 Гц, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-ЯМР (125 МГц, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ расчетное значение: 141,0659, измеренное значение: 141,0663, ИК νмакс 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 см–1.
Семена сорта Columbia (Col-0) были получены из Центра биологических ресурсов арабидопсиса (ABRC) с разрешения на исследовательское использование. Семена сорта Col-0 были размножены и выращены в наших лабораторных условиях и использованы в качестве растений арабидопсиса дикого типа. Семена арабидопсиса были поверхностно стерилизованы и культивированы в среде Мурасиге и Скуга половинной концентрации, содержащей 2% сахарозы (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (вес/объем) 2-(4-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) и 1,5% агара (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, при температуре 23 °C и постоянном освещении. Семена мутанта phs1-1 были предоставлены Т. Хашимото (Нарский институт науки и технологий).
Семена штамма SR-1 были предоставлены Т. Хашимото (Нарский институт науки и технологий) и использованы в качестве диких растений табака. Семена табака были поверхностно стерилизованы и замочены в стерильной воде на три ночи для ускорения прорастания, затем помещены в раствор половинной концентрации, содержащий 2% сахарозы, 0,05% (вес/объём) MES и 0,8% геллановой камеди (среда Мурасиге и Скуга Fujifilm Wako Pure Chemical) с pH 5,7 и инкубированы при температуре 23°C при постоянном освещении.
Штамм Tak-1 был предоставлен Т. Кохчи (Киотский университет) и использован в качестве стандартной экспериментальной единицы для исследования печёночника. Гемму получали из стерилизованных культурных растений, затем высевали на среду Гамборга B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical), содержащую 1% сахарозы и 0,3% геллановой камеди, и инкубировали при температуре 23°C в условиях постоянного освещения.
Клетки табака BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) были предоставлены S. Hasezawa (Токийский университет). Клетки BY-2 были разбавлены в 95 раз в модифицированной среде Линсмейера и Скуга и еженедельно дополнены 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой 32 . Суспензию клеток перемешивали на роторном шейкере со скоростью 130 об/мин при 27 °C в темноте. Промыли клетки 10-кратным объемом свежей среды и ресуспендировали в той же среде. Трансгенные линии клеток BY-2, стабильно экспрессирующие маркер микротрубочек TagRFP-TUA6 или маркер актиновых филаментов GFP-ABD2 под промотором вируса мозаики цветной капусты 35S, были получены, как описано33,34,35. Эти клеточные линии можно поддерживать и синхронизировать с помощью процедур, аналогичных тем, которые использовались для исходной линии клеток BY-2.
Клетки HeLa культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) (Life Technologies) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 1,2 МЕ/мл пенициллина и 1,2 мкг/мл стрептомицина в инкубаторе при температуре 37°C с 5% CO2.
Все эксперименты, описанные в данной рукописи, проводились в соответствии с японскими правилами и рекомендациями по биологической безопасности.
Соединения растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО; Fujifilm Wako Pure Chemical) в виде исходных растворов и разбавляли в среде MS для Arabidopsis и табака или в среде Gamborg B5 для печеночника. Для анализа ингибирования роста корней более 10 семян на чашку высевали на агаризованную среду, содержащую указанные соединения или ДМСО. Семена инкубировали в вегетационной камере в течение 7 дней. Проростки фотографировали и измеряли длину корней. Для анализа прорастания Arabidopsis 48 семян на чашку высевали на агаризованную среду, содержащую 200 мкМ соединения или ДМСО. Семена Arabidopsis выращивали в вегетационной камере, и количество проросших проростков подсчитывали через 7 дней после прорастания (dag). Для анализа прорастания табака 24 семени на чашку высевали на агаризованную среду, содержащую 200 мкМ KAND или ДМСО. Семена табака выращивали в вегетационной камере, и через 14 дней подсчитывали количество проросших сеянцев. Для анализа ингибирования роста печёночника 9 эмбрионов с каждой чашки Петри высевали на агаризованную среду, содержащую указанные концентрации KAND или ДМСО, и инкубировали в вегетационной камере в течение 14 дней.
Для визуализации организации корневой меристемы использовали проростки, окрашенные йодидом пропидия (PI) в концентрации 5 мг/мл. Сигналы PI наблюдали методом флуоресцентной микроскопии с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа TCS SPE (Leica Microsystems).
Гистохимическое окрашивание корней β-глюкуронидазой (GUS) проводили согласно протоколу, описанному Малами и Бенфеем36. Проростки фиксировали в 90% ацетоне в течение ночи, окрашивали 0,5 мг/мл 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-d-глюкуроновой кислотой в буфере GUS в течение 1 часа и помещали в гидратированный раствор хлоральдегида (8 г хлоралгидрата, 2 мл воды и 1 мл глицерина) и наблюдали методом дифференциально-интерференционной контрастной микроскопии с использованием микроскопа Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Углы наклона корней измеряли на 7-дневных сеянцах, выращенных на вертикально расположенных пластинах. Измерьте угол наклона корня относительно направления вектора силы тяжести, как описано в шаге 6.
Расположение кортикальных микротрубочек наблюдали, как описано, с небольшими изменениями в протоколе 37. В качестве первичных и вторичных антител использовали антитела к β-тубулину (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) и конъюгированные с Alexa Fluor 488 антимышиные IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) в разведениях 1:1000 и 1:100 соответственно. Флуоресцентные изображения получали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа TCS SPE (Leica Microsystems). Получайте Z-стек-изображения и создавайте проекции максимальной интенсивности в соответствии с инструкциями производителя.
Анализ пролиферации клеток HeLa проводился с использованием набора Cell Counting Kit 8 (Dojindo) в соответствии с инструкциями производителя.
Рост E. coli DH5α анализировали путем измерения плотности клеток в культуре с использованием спектрофотометра при 600 нм (OD600).
Организацию цитоскелета в трансгенных клетках BY-2 наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного конфокальным сканирующим устройством CSU-X1 (Yokogawa) и sCMOS-камерой (Zyla, Andor Technology). Плотность цитоскелета оценивали с помощью анализа изображений, который количественно определял процент пикселей цитоскелета среди пикселей цитоплазмы на конфокальных изображениях с помощью программы ImageJ, как описано38,39.
Для выявления гибели клеток BY-2 аликвоту клеточной суспензии инкубировали с 0,05% раствором синего Эванса в течение 10 минут при комнатной температуре. Селективное окрашивание мертвых клеток синим Эвансом обусловлено вытеснением красителя из жизнеспособных клеток неповрежденной плазматической мембраной40. Окрашенные клетки наблюдали с помощью микроскопа светлого поля (BX53, Olympus).
Клетки HeLa выращивали в среде DMEM с добавлением 10% FBS во влажном инкубаторе при температуре 37°C и 5% CO2. Клетки обрабатывали 100 мкМ KAND 11, кумамонамовой кислотой 6, кумамонамидом 1, 100 нг/мл колцемида (Gibco) или 100 нг/мл Nocodmaze (Sigma) в течение 6 часов при температуре 37°C. Клетки фиксировали MetOH в течение 10 минут, а затем ацетатом в течение 5 минут при комнатной температуре. Фиксированные клетки инкубировали с первичным антителом к β-тубулину (1D4A4, Proteintech: 66240-1), разбавленным в 0,5% BSA/PBS, в течение 2 часов, промывали 3 раза TBST, а затем инкубировали с козьим антителом Alexa Fluor. 488 в течение 1 часа. – Мышиный IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) и 15 нг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), разведённого в 0,5% BSA/PBS. После трёхкратной промывки TBST окрашенные клетки исследовали под инвертированным микроскопом Nikon Eclipse Ti-E. Изображения получали с помощью охлаждаемой ПЗС-камеры Hamamatsu ORCA-R2 с использованием программного обеспечения MetaMorph (Molecular Devices).
Время публикации: 17 июня 2024 г.