Благодарим вас за посещение Nature.com.Используемая вами версия браузера имеет ограниченную поддержку CSS.Для достижения наилучших результатов мы рекомендуем вам использовать более новую версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer).А пока, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы показываем сайт без стилей и JavaScript.
Открытие и полезное использование натуральных продуктов может помочь улучшить жизнь человека.Химические вещества, ингибирующие рост растений, широко используются в качестве гербицидов для борьбы с сорняками.В связи с необходимостью использования различных типов гербицидов возникает необходимость выявления соединений с новыми механизмами действия.В этом исследовании мы обнаружили новое соединение N-алкоксипиррола, кумамонамид, из Streptomyces werraensis MK493-CF1 и установили полный процесс синтеза.С помощью анализов биологической активности мы обнаружили, что урс-моноаминовая кислота является синтетическим промежуточным продуктом урс-моноамида и потенциальнымингибитор роста растений.Кроме того, нами разработаны различные производные урбеноновой кислоты, в том числе производное урбенилокси (УДА), обладающее высокой гербицидной активностью, не оказывающее негативного влияния на рост клеток HeLa.Мы также обнаружили, что производные урмотоновой кислоты разрушают микротрубочки растений;кроме того, KAND влияет на актиновые филаменты и вызывает гибель клеток;Эти многогранные эффекты отличаются от эффектов известных ингибиторов микротрубочек и предполагают новый механизм действия урсоновой кислоты, что представляет собой важное преимущество при разработке новых гербицидов.
Открытие и практическое применение полезных натуральных продуктов и их производных является средством улучшения качества жизни человека.Вторичные метаболиты, вырабатываемые микроорганизмами, растениями и насекомыми, привели к крупным достижениям в медицине и сельском хозяйстве.Многие антибиотики и лекарства против лейкемии были разработаны из натуральных продуктов.Кроме того, различные видыпестициды, фунгициды и гербициды извлекаются из этих натуральных продуктов для использования в сельском хозяйстве.В частности, гербициды для борьбы с сорняками являются важным инструментом повышения урожайности сельскохозяйственных культур в современном сельском хозяйстве, и различные типы соединений уже используются в коммерческих целях.Некоторые клеточные процессы в растениях, такие как фотосинтез, метаболизм аминокислот, синтез клеточной стенки, регуляция митоза, передача сигналов фитогормонов или синтез белка, считаются типичными мишенями гербицидов.Соединения, ингибирующие функцию микротрубочек, представляют собой распространенный класс гербицидов, которые влияют на рост растений, влияя на митотическую регуляцию2.
Микротрубочки являются компонентами цитоскелета и широко консервативны в эукариотических клетках.Гетеродимер тубулина состоит из α-тубулина и β-тубулина, образующих линейные протофиламенты микротрубочек, при этом 13 протофиламентов образуют цилиндрическую структуру.Микротрубочки играют множество ролей в растительных клетках, в том числе определяют форму клеток, деление клеток и внутриклеточный транспорт3,4.Растительные клетки содержат микротрубочки под интерфазной плазматической мембраной, и считается, что эти так называемые кортикальные микротрубочки контролируют организацию целлюлозных микрофибрилл посредством регуляции целлюлозо-синтазных комплексов4,5.Кортикальные микротрубочки клеток эпидермиса корня, присутствующие в зоне быстрого удлинения кончика корня, расположены латерально, а целлюлозные микроволокна следуют за этими микротрубочками и ограничивают направление клеточного расширения, тем самым способствуя анизотропному удлинению клеток.Следовательно, функция микротрубочек тесно связана с морфологией растений.Аминокислотные замены в генах, кодирующих тубулин, вызывают перекос массивов кортикальных микротрубочек и лево- или правосторонний рост у Arabidopsis 6,7.Сходным образом, мутации в белках, ассоциированных с микротрубочками, которые регулируют динамику микротрубочек, также могут приводить к нарушению роста корней8,9,10,11,12,13.Кроме того, обработка гербицидами, разрушающими микротрубочки, такими как дизопирамид, также известный как претилахлор, также вызывает рост левостороннего косого корня14.Эти данные показывают, что точная регуляция функции микротрубочек имеет решающее значение для определения направления роста растений.
Были открыты различные типы ингибиторов микротрубочек, и эти препараты внесли значительный вклад в исследования цитоскелета, а также в сельское хозяйство и медицину2.В частности, оризалин, соединения динитроанилина, дизопирамид, соединения, родственные бензамиду, и их аналоги могут ингибировать функцию микротрубочек и тем самым ингибировать рост растений.Поэтому их широко используют в качестве гербицидов.Однако, поскольку микротрубочки являются важным компонентом растительных и животных клеток, большинство ингибиторов микротрубочек цитотоксичны для обоих типов клеток.Поэтому, несмотря на их общепризнанную полезность в качестве гербицидов, в практических целях используется ограниченное количество антимикротрубочковых агентов.
Streptomyces — род семейства Streptomyces, который включает аэробные, грамположительные, нитчатые бактерии и широко известен своей способностью продуцировать широкий спектр вторичных метаболитов.Поэтому его считают одним из важнейших источников новых биологически активных натуральных продуктов.В текущем исследовании мы обнаружили новое соединение под названием кумамонамид, которое было выделено из Streptomyces werraensis MK493-CF1 и S. werraensis ISP 5486. С помощью спектрального анализа и полного спектрального анализа была охарактеризована структура кумамонамида и его уникальный N-алкоксипиррольный скелет. был определен.синтез.Было обнаружено, что урсмоновая кислота, синтетический промежуточный продукт урсмоноамида и его производных, подавляет рост и прорастание популярного модельного растения Arabidopsis thaliana.В исследовании взаимосвязи структура-активность мы обнаружили, что соединение с C9, модифицированным до урсоновой кислоты, называемое нонилоксипроизводным урсоновой кислоты (КАНД), значительно усиливает ингибирующее действие на рост и прорастание.Примечательно, что недавно обнаруженный ингибитор роста растений также влиял на рост табака и печеночника и не был цитотоксичен для бактерий или клеток HeLa.Более того, некоторые производные урмотоновой кислоты вызывают искаженный фенотип корней, подразумевая, что эти производные прямо или косвенно влияют на микротрубочки.В соответствии с этой идеей наши наблюдения за микротрубочками, меченными либо иммуногистохимически, либо флуоресцентными белками, показывают, что обработка KAND деполимеризует микротрубочки.Кроме того, обработка производными кумамотоновой кислоты разрушала актиновые микрофиламенты.Таким образом, мы открыли новый ингибитор роста растений, уникальный механизм действия которого заключается в разрушении цитоскелета.
Штамм MK493-CF1 был выделен из почвы в Синагава-ку, Токио.Штамм МК493-CF1 формировал хорошо разветвленный стромальный мицелий.Определена частичная последовательность гена 16S рибосомальной РНК (1422 п.н.).Этот штамм очень похож на S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 п.о., T: типичный штамм, 99,93%).На основании этого результата было установлено, что этот штамм тесно связан с типовым штаммом S. werraensis.Поэтому мы условно назвали этот штамм S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T также производит те же биологически активные соединения.Поскольку ранних исследований по получению натуральных продуктов из этого микроорганизма было мало, были проведены дальнейшие химические исследования.После культивирования S. werraensis MK493-CF1 на ячменной среде методом твердофазной ферментации при 30°C в течение 14 дней среду экстрагировали 50% EtOH.60 мл образца сушили с получением 59,5 мг сырого экстракта.Неочищенный экстракт подвергали ВЭЖХ с обращенной фазой, получая N-метокси-1Н-пиррол-2-карбоксамид (1, названный кумамонамид, 36,0 мг).Общее количество 1 составляет примерно 60% сырого экстракта.Поэтому мы решили детально изучить свойства кумамотоамида 1.
Кумамонамид 1 представляет собой белый аморфный порошок, и масс-спектрометрия высокого разрешения (HRESIMS) подтверждает C6H8N2O2 (рис. 1).С2-замещенный пиррольный фрагмент этого соединения характеризуется δH 6.94 (1H, т, J = 2.8, 4.8 Гц, H-4), δH 6.78 (1H, д, J = 2.5, δH в спектре ЯМР 1Н: 4.5 Гц). , H-5) и δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Гц, H-6), а в спектре ЯМР 13С показано наличие четырех атомов углерода sp2.Наличие амидной группы в положении С2 оценивали по корреляции HMBC от протона С-3 к карбонильному углероду амида при δC 161,1.Кроме того, пики ЯМР 1 Н и 13 С при δH 4.10 (3H, S) и δC 68.3 указывают на наличие N-метоксигрупп в молекуле.Хотя правильное положение метоксигруппы еще не было определено с помощью спектроскопического анализа, такого как расширенная разностная спектроскопия и ядерная аббревиатура Оверхаузера (NOEDF), N-метокси-1H-пиррол-2-карбоксамид стал первым соединением-кандидатом.
Для определения правильной структуры 1 был проведен полный синтез (рис. 2а).Обработка коммерчески доступного 2-аминопиридина 2 м-ХПБА привела к получению соответствующего N-оксида 3 с количественным выходом.После 2-аминоазидирования 2 проводили реакцию циклоконденсации, описанную Абрамовичем, в бензоле при 90°С с получением искомого 1-гидрокси-1Н-пиррол-2-карбонитрила 5 в граммах.Скорость 60% (два этапа).15,16.Метилирование и гидролиз 4 затем дали 1-метокси-1H-пиррол-2-карбоновую кислоту (называемую «кумотоновой кислотой», 6) с хорошим выходом (70%, две стадии).Наконец, амидирование через промежуточный хлорангидрид 6 с использованием водного раствора аммиака дало амид Кумамото 1 с выходом 98%.Все спектральные данные синтезированного 1 были аналогичны изолированному 1, что позволило определить структуру 1;
Общий синтез и анализ биологической активности урбенамида и урбеновой кислоты.( а ) Полный синтез амида Кумамото.(b) Семидневные сеянцы Arabidopsis Columbia (Col) дикого типа выращивали на чашках Мурасиге и Скуга (MS), содержащих кумамонамид 6 или кумамонамид 1 в указанных концентрациях.Масштабная линейка = 1 см.
Во-первых, мы оценили биологическую активность урбенамида и его промежуточных продуктов на предмет их способности модулировать рост растений.Мы добавляли различные концентрации урсмонамида 1 или урсмоновой кислоты 6 в агаризованную среду MS и культивировали на этой среде проростки Arabidopsis thaliana.Эти анализы показали, что высокие концентрации (500 мкМ) 6 ингибируют рост корней (рис. 2б).Затем мы создали различные производные, заменяя положение N1 числа 6, и провели исследования взаимосвязи структура-активность на них (процесс синтеза аналогов описан в вспомогательной информации (SI)).Проростки арабидопсиса выращивали на среде, содержащей 50 мкМ производных урсоновой кислоты, и измеряли длину корней.как показано на картинке.Как показано на рисунках 3a, b и S1, кумамокислоты имеют разную длину линейных алкоксицепей (9, 10, 11, 12 и 13) или больших алкоксицепей (15, 16 и 17) в положении N1.Производные показали значительное ингибирование роста корней.Кроме того, мы обнаружили, что применение 200 мкМ 10, 11 или 17 ингибирует прорастание (рис. 3в и S2).
Исследование взаимосвязи структура-активность амида Кумамото и родственных соединений.(а) Структура и схема синтеза аналогов.( б ) Количественная оценка длины корней 7-дневных сеянцев, выращенных на среде MS с 50 мкМ производными кумамонамида или без них.Звездочки указывают на существенные различия с фиктивным лечением (t-критерий, p< 0,05).п>18. Данные представлены как среднее ± SD.nt означает «не тестировалось», поскольку более 50% семян не проросли.(c) Количественная оценка скорости прорастания обработанных семян, инкубированных в течение 7 дней в среде MS с 200 мкМ кумамонамида и родственных соединений или без них.Звездочки указывают на существенные различия с фиктивным лечением (критерий хи-квадрат).п=96.
Интересно, что добавление алкильных боковых цепей, длиннее C9, снижает ингибирующую активность, что позволяет предположить, что соединениям, родственным кумамотоовой кислоте, требуются боковые цепи определенного размера, чтобы проявлять свою биологическую активность.
Поскольку анализ взаимосвязи структура-активность показал, что C9 был модифицирован до урсоновой кислоты, а нонилоксипроизводное урсоновой кислоты (далее называемое KAND 11) было наиболее эффективным ингибитором роста растений, мы провели более детальную характеристику KAND 11. Лечение арабидопсиса 50 мкМ КАНД-11 практически полностью предотвращал прорастание, тогда как более низкие концентрации (40, 30, 20 или 10 мкМ) КАНД-11 дозозависимо ингибировали рост корней (рис. 4а, б).Чтобы проверить, влияет ли KAND 11 на жизнеспособность корневой меристемы, мы исследовали корневые меристемы, окрашенные йодидом пропидия (PI), и измерили размер площади меристемы.Размер меристемы проростков, выращенных на среде с 25 мкМ КАНД-11, составил 151,1 ± 32,5 мкм, тогда как размер меристемы проростков, выращенных на контрольной среде с ДМСО, составил 264,7 ± 30,8 мкм (рис. 4в, г). , что указывает на то, что КАНД-11 восстанавливает клеточную активность.распространение.Корневая меристема.В соответствии с этим, обработка KAND 11 уменьшала количество сигнала маркера клеточного деления CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS в корневой меристеме (Рис. 4e) 17 .Эти результаты показывают, что KAND 11 ингибирует рост корней за счет снижения активности пролиферации клеток.
Анализ ингибирующего действия производных урбеноновой кислоты (урбенилоксипроизводных) на рост.( а ) 7-дневные сеянцы Col дикого типа, выращенные на чашках MS с указанными концентрациями KAND 11. Масштабная полоса = 1 см.(б) Количественная оценка длины корня.Буквы обозначают существенные различия (тест Тьюки HSD, стр.< 0,05).п>16. Данные показаны как среднее ± SD.( c ) Конфокальная микроскопия окрашенных йодидом пропидия корней Col дикого типа, выращенных на чашках MS с 25 мкМ KAND 11 или без него. Белые скобки обозначают корневую меристему.Масштабная линейка = 100 мкм.( d ) Количественная оценка размера корневой меристемы (n = от 10 до 11).Статистические различия определяли с помощью t-критерия (p< 0,05).Столбики представляют средний размер меристемы.( e ) Микроскопия дифференциально-интерференционного контраста (DIC) корневой меристемы, содержащей конструкцию CDKB2;1про: CDKB2;Окрашивание 1-GUS и окрашивание 5-дневных проростков, выращенных на чашках MS с использованием или без анализа KAND 25 мкМ.
Фитотоксичность KAND 11 была дополнительно проверена с использованием другого двудольного растения, табака (Nicotiana tabacum), и основного модельного организма наземного растения, печеночника (Marchantia polymorpha).Как и в случае арабидопсиса, проростки табака SR-1, выращенные на среде с 25 мкМ КАНД 11, давали более короткие корни (рис. 5а).Кроме того, 40 из 48 семян проросли на чашках, содержащих 200 мкМ KAND 11, тогда как все 48 семян проросли на среде, обработанной имитацией, что указывает на то, что более высокие концентрации KAND были значимыми (p< 0,05;хи-тест-квадрат) подавлял прорастание табака.(рис. 5б).Кроме того, концентрация KAND 11, ингибирующая рост бактерий в печеночнице, была аналогична эффективной концентрации в Arabidopsis (рис. 5в).Эти результаты показывают, что KAND 11 может подавлять рост множества растений.Затем мы исследовали возможную цитотоксичность соединений, родственных моноамиду медведя, в других организмах, а именно в клетках HeLa человека и штамме Escherichia coli DH5α, как представителях высших животных и бактериальных клеток соответственно.В серии анализов клеточной пролиферации мы наблюдали, что кумамонамид 1, кумамонамидовая кислота 6 и KAND 11 не влияли на рост клеток HeLa или E. coli в концентрациях 100 мкМ (рис. 5d,e).
Ингибирование роста KAND 11 у организмов, не относящихся к Arabidopsis.(a) Двухнедельные сеянцы табака SR-1 дикого типа выращивали на вертикально расположенных чашках MS, содержащих 25 мкМ KAND 11. (b) Двухнедельные сеянцы табака SR-1 дикого типа выращивали на горизонтально расположенных Планшеты MS, содержащие 200 мкМ KAND 11. ( c ) Двухнедельные почки печеночника Tak-1 дикого типа, выращенные на чашках Gamborg B5 с указанными концентрациями KAND 11. Красные стрелки указывают на споры, которые перестали расти в течение двухнедельной инкубации. период.( d ) Анализ клеточной пролиферации клеток HeLa.Количество жизнеспособных клеток измеряли через фиксированные интервалы времени с использованием набора для подсчета клеток 8 (Dojindo).В качестве контроля клетки HeLa обрабатывали 5 мкг/мл актиномицина D (Act D), который ингибирует транскрипцию РНК-полимеразы и вызывает гибель клеток.Анализы проводились в трех повторах.(д) Анализ пролиферации клеток E. coli.Рост E.coli анализировали путем измерения OD600.В качестве контроля клетки обрабатывали 50 мкг/мл ампициллина (Amp), который ингибирует синтез клеточной стенки бактерий.Анализы проводились в трех повторностях.
Для расшифровки механизма действия цитотоксичности, вызываемой соединениями урамидного ряда, мы повторно проанализировали производные урбеновой кислоты с умеренным ингибирующим действием.как показано на картинке.Как показано на рисунках 2б, 6а, проростки, выращенные на чашках с агаром, содержащим высокие концентрации (200 мкМ) урмотоновой кислоты 6, давали более короткие и левоизогнутые корни (θ = – 23,7 ± 6,1), тогда как у проростков, выращенных на контрольной среде, у сеянцев образовались почти прямые корни (θ = – 3,8 ± 7,1).Известно, что этот характерный косой рост является результатом дисфункции кортикальных микротрубочек14,18.В соответствии с этим открытием, препараты, дестабилизирующие микротрубочки, дизопирамид и оризалин, индуцировали сходный наклон корней в наших условиях роста (рис. 2b, 6a).В то же время мы протестировали производные урмотоновой кислоты и выбрали несколько из них, которые в определенных концентрациях индуцировали косой рост корней.Соединения 8, 9 и 15 изменяли направление роста корней при 75 мкМ, 50 мкМ и 40 мкМ соответственно, что указывает на то, что эти соединения способны эффективно дестабилизировать микротрубочки (рис. 2б, 6а).Мы также протестировали наиболее мощное производное урсоловой кислоты, КАНД 11, в более низкой концентрации (15 мкМ) и обнаружили, что применение КАНД 11 ингибирует рост корней и что направление роста корней было неравномерным, хотя они имели тенденцию наклоняться влево ( Рисунок С3)..Поскольку более высокие концентрации препаратов, дестабилизирующих микротрубочки, иногда подавляют рост растений, а не вызывают наклон корней, впоследствии мы оценили возможность того, что KAND 11 влияет на микротрубочки, наблюдая кортикальные микротрубочки в клетках эпидермиса корня.Иммуногистохимия с использованием анти-β-тубулиновых антител в эпидермальных клетках корней проростков, обработанных 25 мкМ КАНД 11, показала исчезновение практически всех кортикальных микротрубочек в эпидермальных клетках в зоне элонгации (рис. 6б).Эти результаты показывают, что кумамотоновая кислота и ее производные действуют прямо или косвенно на микротрубочки, разрушая их, и что эти соединения являются новыми ингибиторами микротрубочек.
Урзвуковая кислота и ее производные изменяют кортикальные микротрубочки Arabidopsis thaliana.(а) Угол наклона корня, измеренный в присутствии различных производных урмотоновой кислоты в указанных концентрациях.Также были проанализированы эффекты двух соединений, которые, как известно, ингибируют микротрубочки: дизопирамида и оризалина.На вставке показан эталон, используемый для измерения угла роста корня.Звездочки указывают на значительные различия с фиктивным лечением (t-критерий, p< 0,05).п>19. Масштабная линейка = 1 см.(б) Кортикальные микротрубочки в эпидермальных клетках в зоне элонгации.Микротрубочки в корнях Arabidopsis Col дикого типа, выращенных на чашках MS с 25 мкМ KAND 11 или без него, визуализировались с помощью иммуногистохимического окрашивания с использованием первичных антител к β-тубулину и вторичных антител, конъюгированных с Alexa Fluor.Масштабная линейка = 10 мкм.(в) Митотическая структура микротрубочек корневой меристемы.Микротрубочки визуализировали с помощью иммуногистохимического окрашивания.Митотические структуры, включая профазные зоны, веретена и фрагмопласты, подсчитывали по конфокальным изображениям.Стрелки указывают митотические структуры микротрубочек.Звездочки указывают на значительные различия с фиктивным лечением (t-критерий, p< 0,05).п>9. Масштабная линейка = 50 мкм.
Хотя Ursa обладает способностью нарушать функцию микротрубочек, ожидается, что механизм ее действия будет отличаться от механизма действия типичных агентов, деполимеризующих микротрубочки.Например, более высокие концентрации агентов, деполимеризующих микротрубочки, таких как дизопирамид и оризалин, индуцируют анизотропное расширение эпидермальных клеток, тогда как KAND 11 этого не делает.Кроме того, совместное применение KAND 11 и дизопирамида привело к комбинированной реакции роста корней, индуцированной дизопирамидом, и наблюдалось ингибирование роста, индуцированное KAND 11 (рис. S4).Мы также проанализировали реакцию гиперчувствительного мутанта дизопирамида 1-1 (phs1-1) на KAND 11. phs1-1 имеет неканоническую точечную мутацию тубулинкиназы и дает более короткие корни при обработке дизопирамидом9,20.Проростки мутанта phs1-1, выращенные на агаризованной среде, содержащей КАНД 11, имели более короткие корни, аналогичные тем, что росли на дизопирамиде (рис. S5).
Кроме того, мы наблюдали митотические структуры микротрубочек, такие как профазные зоны, веретена и фрагмопласты, в корневой меристеме проростков, обработанных KAND 11. В соответствии с наблюдениями для CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, значительное снижение наблюдалось количество митотических микротрубочек (рис. 6в).
Чтобы охарактеризовать цитотоксичность KAND 11 при субклеточном разрешении, мы обработали суспензионные клетки табака BY-2 KAND 11 и наблюдали их реакцию.Сначала мы добавили KAND 11 к клеткам BY-2, экспрессирующим TagRFP-TUA6, который флуоресцентно маркирует микротрубочки, чтобы оценить влияние KAND 11 на кортикальные микротрубочки.Плотность кортикальных микротрубочек оценивали с помощью анализа изображений, который количественно определял процент цитоскелетных пикселей среди цитоплазматических пикселей.Результаты анализа показали, что после обработки 50 мкМ или 100 мкМ КАНД 11 в течение 1 часа плотность значительно снизилась до 0,94 ± 0,74% или 0,23 ± 0,28% соответственно, тогда как плотность клеток, обработанных ДМСО, составила 1,61 ± 0,34. % (рис. 7а).Эти результаты согласуются с наблюдением у Arabidopsis, что обработка KAND 11 индуцирует деполимеризацию кортикальных микротрубочек (рис. 6b).Мы также исследовали линию BY-2 с актиновыми нитями, меченными GFP-ABD, после обработки той же концентрацией KAND 11 и заметили, что обработка KAND 11 разрушает актиновые нити.Обработка 50 мкМ или 100 мкМ KAND 11 в течение 1 ч достоверно снижала плотность актиновых филаментов до 1,20 ± 0,62% или 0,61 ± 0,26% соответственно, тогда как плотность в клетках, обработанных ДМСО, составляла 1,69 ± 0,51% (рис. 2).7б).Эти результаты контрастируют с эффектами пропизамида, который не влияет на актиновые нити, и латрункулина B, деполимеризатора актина, который не влияет на микротрубочки (SI Рисунок S6).Кроме того, обработка кумамонамидом 1, кумамонамидной кислотой 6 или KAND 11 не повлияла на микротрубочки в клетках HeLa (SI, рисунок S7).Таким образом, полагают, что механизм действия KAND 11 отличается от механизма действия известных разрушителей цитоскелета.Кроме того, наше микроскопическое наблюдение за клетками BY-2, обработанными KAND 11, выявило начало гибели клеток во время обработки KAND 11 и показало, что доля окрашенных синим Эвансом мертвых клеток не увеличивалась значительно после 30 минут обработки KAND 11, тогда как после 90 минут обработки 50 мкМ или 100 мкМ КАНД количество мертвых клеток увеличивалось до 43,7% или 80,1% соответственно (рис. 7в).В совокупности эти данные указывают на то, что новое производное урсоловой кислоты KAND 11 является растительно-специфичным ингибитором цитоскелета с ранее неизвестным механизмом действия.
KAND влияет на кортикальные микротрубочки, актиновые филаменты и жизнеспособность клеток BY-2 табака.( а ) Визуализация кортикальных микротрубочек в клетках BY-2 в присутствии TagRFP-TUA6.Клетки BY-2, обработанные KAND 11 (50 мкМ или 100 мкМ) или ДМСО, исследовали с помощью конфокальной микроскопии.Плотность кортикальных микротрубочек рассчитывали по микрофотографиям 25 независимых клеток.Буквы обозначают существенные различия (тест Тьюки HSD, стр.< 0,05).Масштабная линейка = 10 мкм.(б) Кортикальные актиновые филаменты в клетках BY-2, визуализированные в присутствии GFP-ABD2.Клетки BY-2, обработанные KAND 11 (50 мкМ или 100 мкМ) или ДМСО, исследовали с помощью конфокальной микроскопии.Плотность кортикальных актиновых филаментов рассчитывали по микрофотографиям 25 независимых клеток.Буквы обозначают существенные различия (тест Тьюки HSD, стр.< 0,05).Масштабная линейка = 10 мкм.(c) Наблюдение за мертвыми клетками BY-2 при окрашивании синим Эвансом.Клетки BY-2, обработанные KAND 11 (50 мкМ или 100 мкМ) или ДМСО, исследовали с помощью светлопольной микроскопии.п=3.Масштабная линейка = 100 мкм.
Открытие и применение новых натуральных продуктов привело к значительному прогрессу в различных аспектах жизни человека, включая медицину и сельское хозяйство.Были проведены исторические исследования по получению полезных соединений из природных ресурсов.В частности, известно, что актиномицеты полезны в качестве противопаразитарных антибиотиков для нематод благодаря их способности продуцировать различные вторичные метаболиты, такие как авермектин, ведущее соединение ивермектина и блеомицина и его производных, используемых в медицине в качестве противоракового средства21,22.Аналогичным образом, из актиномицетов было обнаружено множество гербицидных соединений, некоторые из которых уже используются в коммерческих целях1,23.Таким образом, анализ метаболитов актиномицетов для выделения натуральных продуктов с желаемой биологической активностью считается эффективной стратегией.В этом исследовании мы обнаружили новое соединение, кумамонамид, из S. werraensis и успешно синтезировали его.Урзвуковая кислота является синтетическим промежуточным продуктом урбенамида и его производных.Он может вызывать характерное скручивание корней, проявлять гербицидную активность от умеренной до сильной и прямо или косвенно повреждать микротрубочки растений.Однако механизм действия урмотоновой кислоты может отличаться от механизма действия существующих ингибиторов микротрубочек, поскольку KAND 11 также разрушает актиновые филаменты и вызывает гибель клеток, что указывает на регуляторный механизм, с помощью которого урмотоновая кислота и ее производные влияют на широкий спектр цитоскелетных структур..
Дальнейшая детальная характеристика урбеноновой кислоты поможет лучше понять механизм действия урбеноновой кислоты.В частности, следующая цель — оценить способность урсоновой кислоты связываться с восстановленными микротрубочками, чтобы определить, действуют ли урсоновая кислота и ее производные непосредственно на микротрубочки и деполимеризуют их, или же их действие приводит к дестабилизации микротрубочек.Кроме того, в случае, когда микротрубочки не являются прямой мишенью, идентификация места действия и молекулярных мишеней урсоновой кислоты на растительных клетках поможет дополнительно понять свойства родственных соединений и возможные пути улучшения гербицидной активности.Наш анализ биологической активности выявил уникальную цитотоксическую способность урсоновой кислоты в отношении роста таких растений, как Arabidopsis thaliana, табак и печеночник, при этом ни E. coli, ни клетки HeLa не были затронуты.Незначительная токсичность или отсутствие токсичности для клеток животных является преимуществом производных урсоновой кислоты, если они разрабатываются в качестве гербицидов для использования на открытых сельскохозяйственных полях.Действительно, поскольку микротрубочки являются обычными структурами у эукариот, их избирательное ингибирование у растений является ключевым требованием для гербицидов.Например, пропизамид, агент, деполимеризующий микротрубочки, который напрямую связывается с тубулином и ингибирует полимеризацию, используется в качестве гербицида из-за его низкой токсичности для клеток животных24.В отличие от дизопирамида родственные бензамиды обладают различной целевой специфичностью.Помимо растительных микротрубочек, RH-4032 или бензоксамид также ингибируют микротрубочки животных клеток или оомицетов соответственно, а залиламид используется в качестве фунгицида из-за его низкой фитотоксичности25,26,27.Недавно обнаруженный медвежонок и его производные проявляют избирательную цитотоксичность в отношении растений, но стоит отметить, что дальнейшие модификации могут изменить их целевую специфичность, потенциально обеспечивая дополнительные производные для контроля патогенных грибов или оомицетов.
Уникальные свойства урбеноновой кислоты и ее производных полезны для их разработки в качестве гербицидов и использования в качестве исследовательских инструментов.Важность цитоскелета в контроле формы растительных клеток широко признана.Более ранние исследования показали, что растения развили сложные механизмы организации кортикальных микротрубочек, контролируя динамику микротрубочек для правильного контроля морфогенеза.Было идентифицировано большое количество молекул, ответственных за регуляцию активности микротрубочек, и соответствующие исследования все еще продолжаются3,4,28.Наше нынешнее понимание динамики микротрубочек в растительных клетках не полностью объясняет механизмы кортикальной организации микротрубочек.Например, хотя и дизопирамид, и оризалин могут деполимеризовать микротрубочки, дизопирамид вызывает серьезное искажение корней, тогда как оризалин оказывает относительно мягкий эффект.Более того, мутации тубулина, который стабилизирует микротрубочки, также вызывают правовращание корней, тогда как паклитаксел, который также стабилизирует динамику микротрубочек, этого не делает.Следовательно, изучение и идентификация молекулярных мишеней урсоловой кислоты должны дать новое представление о регуляции корковых микротрубочек растений.Аналогичным образом, будущие сравнения химических веществ, которые эффективно способствуют нарушению роста, таких как дизопирамид, и менее эффективных химических веществ, таких как оризалин или кумамоторная кислота, дадут ключ к пониманию того, как происходит нарушение роста.
С другой стороны, перестройки цитоскелета, связанные с защитой, являются еще одной возможностью объяснить цитотоксичность урсоновой кислоты.Заражение возбудителем или введение элиситора в растительные клетки иногда приводит к разрушению цитоскелета и последующей гибели клеток29.Например, сообщалось, что криптоксантин, полученный из оомицетов, разрушает микротрубочки и актиновые нити перед гибелью клеток табака, аналогично тому, что происходит при лечении KAND30,31.Сходство между защитными реакциями и клеточными реакциями, индуцируемыми урсоновой кислотой, привело нас к гипотезе, что они запускают общие клеточные процессы, хотя очевиден более быстрый и сильный эффект урсоновой кислоты, чем криптоксантина.Однако исследования показали, что разрушение актиновых филаментов способствует спонтанной гибели клеток, которая не всегда сопровождается разрушением микротрубочек29.Кроме того, еще предстоит выяснить, вызывает ли патоген или элиситор искаженный рост корней, как это делают производные урсоновой кислоты.Таким образом, молекулярные знания, связывающие защитные реакции и цитоскелет, являются привлекательной проблемой, требующей решения.Используя присутствие низкомолекулярных соединений, родственных урсоновой кислоте, а также ряда производных с различной эффективностью, они могут предоставить возможности воздействовать на неизвестные клеточные механизмы.
В совокупности открытие и применение новых соединений, которые модулируют динамику микротрубочек, предоставят мощные методы для решения сложных молекулярных механизмов, лежащих в основе определения формы растительных клеток.В этом контексте недавно разработанное соединение урмотоновой кислоты, которое влияет на микротрубочки и актиновые филаменты и вызывает гибель клеток, может предоставить возможность расшифровать связь между контролем микротрубочек и этими другими механизмами.Таким образом, химический и биологический анализ с использованием урбеноновой кислоты поможет нам понять молекулярные регуляторные механизмы, контролирующие цитоскелет растений.
Инокулируют S. werraensis MK493-CF1 в колбу Эрленмейера с перегородкой емкостью 500 мл, содержащую 110 мл посевной среды, состоящей из 2% (мас./об.) галактозы, 2% (мас./об.) пасты Essence, 1% (мас./об.) композиции Bacto. .-сойтон (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (масс./об.) кукурузного экстракта (KOGOSTCH Co., Ltd., Япония), 0,2% (мас./об.) (NH4)2SO4 и 0,2% CaCO3 в деионизированной воде.(рН 7,4 перед стерилизацией).Посевные культуры инкубировали на ротационной шейкере (180 об/мин) при 27°С в течение 2 дней.Производственное выращивание посредством твердофазной ферментации.Посевную культуру (7 мл) переносили в колбу К-1 емкостью 500 мл, содержащую 40 г продукционной среды, состоящей из 15 г прессованного ячменя (MUSO Co., Ltd., Япония) и 25 г деионизированной воды (рН не доведено до нормы). перед стерилизацией).).Ферментацию проводили при 30°С в темноте в течение 14 дней.Ферментационный материал экстрагировали 40 мл/флакон EtOH и центрифугировали (1500 g, 4°C, 10 мин).Культуральный супернатант (60 мл) экстрагировали смесью 10% MeOH/EtOAc.Органический слой упаривали при пониженном давлении с получением остатка (59,5 мг), который подвергали ВЭЖХ с градиентным элюированием (0–10 минут: 90%) на колонке с обращенной фазой (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 мкм, ID). 10 мм × длина 250 мм) H2O/CH3CN, 10–35 минут: от 90 % H2O/CH3CN до 70 % H2O/CH3CN (градиент), 35–45 минут: 90 % H2O/EtOH, 45–155 минут: 90 % H2O /EtOH до 100% EtOH (градиент (градиент), 155–200 мин: 100% EtOH) при скорости потока 1,5 мл/мин выделяли кумамонамид (1, 36,0 мг) в виде белого аморфного порошка.
Кумамотоамид(1);1H-ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ 6,93 (т, J=2,5 Гц, 1H), 6,76 (дд, J=4,3, 1,8 Гц 1H), 6,05 (т, J=3,8 Гц, 1H).), 4,08 (с, 3H);13С-ЯМР (125 МГц, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ расчетное значение: 141,0659, измеренное значение: 141,0663, ИК νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 см–1.
Семена Колумбии (Col-0) были получены из Центра биологических ресурсов арабидопсиса (ABRC) с разрешением на исследовательское использование.Семена Col-0 размножали и поддерживали в наших лабораторных условиях и использовали в качестве растений арабидопсиса дикого типа.Семена Arabidopsis подвергали поверхностной стерилизации и культивировали в среде Мурасиге и Скуга половинной концентрации, содержащей 2% сахарозы (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (мас./об.) 2-(4-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ).) и 1,5% агара (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, при 23 °C и постоянном освещении.Семена мутанта phs1-1 были предоставлены Т. Хашимото (Институт науки и технологий Нары).
Семена штамма SR-1 были предоставлены Т. Хашимото (Институт науки и технологий Нары) и использованы в качестве растений табака дикого типа.Семена табака подвергали поверхностной стерилизации и замачивали в стерильной воде на три ночи для ускорения прорастания, затем помещали в раствор половинной концентрации, содержащий 2% сахарозы, 0,05% (мас./об.) MES и 0,8% геллановой камеди (Fujifilm Wako Pure Chemical). Мурасиге.и среду Скуга) с pH 5,7 и инкубировали при 23°C при постоянном освещении.
Штамм Tak-1 был предоставлен Т. Кочи (Киотский университет) и использовался в качестве стандартной экспериментальной единицы для исследования печеночника.Gemma получали из стерилизованных культивируемых растений, а затем высевали на среду Гамборга B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical), содержащую 1% сахарозы и 0,3% геллановой камеди, и инкубировали при 23°C при непрерывном освещении.
Клетки табака BY-2 (Nicotiana tabacum L. сорт Bright Yellow 2) были предоставлены S. Hasezawa (Токийский университет).Клетки BY-2 разводили в 95 раз в модифицированной среде Линсмейера и Скуга и еженедельно добавляли 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту 32 .Клеточную суспензию перемешивали на ротационной шейкере при 130 об/мин при 27°С в темноте.Промойте клетки 10-кратным объемом свежей среды и ресуспендируйте в той же среде.Трансгенные клеточные линии BY-2, стабильно экспрессирующие маркер микротрубочек TagRFP-TUA6 или маркер актиновых филаментов GFP-ABD2 под промотором 35S вируса мозаики цветной капусты, были созданы, как описано33,34,35.Эти клеточные линии можно поддерживать и синхронизировать с использованием процедур, аналогичных тем, которые использовались для исходной клеточной линии BY-2.
Клетки HeLa культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) (Life Technologies) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 1,2 ед/мл пенициллина и 1,2 мкг/мл стрептомицина в инкубаторе с температурой 37°C и 5% CO2.
Все эксперименты, описанные в этой рукописи, проводились в соответствии с японскими правилами и рекомендациями по биобезопасности.
Соединения растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО; Fujifilm Wako Pure Chemical) в виде исходных растворов и разбавляли средой MS для арабидопсиса и табака или средой Гамборга B5 для печеночника.Для анализа ингибирования роста корней более 10 семян на чашку высевали на агаровую среду, содержащую указанные соединения или ДМСО.Семена инкубировали в ростовой камере в течение 7 дней.Саженцы фотографировали и измеряли длину корней.Для анализа прорастания арабидопсиса 48 семян на чашку высевали на агаровую среду, содержащую 200 мкМ соединения или ДМСО.Семена арабидопсиса выращивали в ростовой камере и подсчитывали количество проросших сеянцев через 7 дней после прорастания (даг).Для анализа прорастания табака 24 семени на чашку высевали на агаровую среду, содержащую 200 мкМ КАНД или ДМСО.Семена табака выращивали в ростовой камере и через 14 дней подсчитывали количество проросших сеянцев.Для анализа ингибирования роста печеночника 9 эмбрионов из каждой чашки высевали на агаровую среду, содержащую указанные концентрации КАНД или ДМСО, и инкубировали в камере роста в течение 14 дней.
Используйте саженцы, окрашенные йодидом пропидия (PI) в концентрации 5 мг/мл, чтобы визуализировать организацию корневой меристемы.Сигналы PI наблюдались с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа TCS SPE (Leica Microsystems).
Гистохимическое окрашивание корней β-глюкуронидазой (GUS) проводили в соответствии с протоколом, описанным Малами и Бенфеем36.Проростки фиксировали в 90% ацетоне на ночь, окрашивали 0,5 мг/мл 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-d-глюкуроновой кислоты в буфере GUS на 1 час и помещали в гидратированный раствор хлоральдегида.(8 г хлоралгидрата, 2 мл воды и 1 мл глицерина) и наблюдали с помощью дифференциально-интерференционной контрастной микроскопии с использованием микроскопа Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Углы корней измеряли у 7-дневных сеянцев, выращенных на вертикально расположенных чашках.Измерьте угол корня относительно направления вектора силы тяжести, как описано в шаге 6.
Расположение корковых микротрубочек наблюдалось, как описано, с небольшими изменениями в протоколе 37 .Антитело против β-тубулина (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) и конъюгированный с Alexa Fluor 488 антимышиный IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) использовали в качестве первичных и вторичных антител в разведениях 1:1000 и 1:100. соответственно.Флуоресцентные изображения получали с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа TCS SPE (Leica Microsystems).Получите изображения Z-стека и создайте проекции максимальной интенсивности в соответствии с инструкциями производителя.
Анализ пролиферации клеток HeLa проводили с использованием набора для подсчета клеток 8 (Dojindo) в соответствии с инструкциями производителя.
Рост E. coli DH5α анализировали путем измерения плотности клеток в культуре с использованием спектрофотометра при 600 нм (OD600).
Цитоскелетную организацию в трансгенных клетках BY-2 наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного конфокальным сканирующим устройством CSU-X1 (Yokogawa) и sCMOS-камерой (Zyla, Andor Technology).Плотность цитоскелета оценивали с помощью анализа изображений, который количественно определял процент цитоскелетных пикселей среди цитоплазматических пикселей на конфокальных изображениях с использованием программного обеспечения ImageJ, как описано38,39.
Для обнаружения гибели клеток в клетках BY-2 аликвоту клеточной суспензии инкубировали с 0,05% синим Эванса в течение 10 минут при комнатной температуре.Селективное окрашивание мертвых клеток синим Эванса зависит от экструзии красителя из жизнеспособных клеток неповрежденной плазматической мембраной40.Окрашенные клетки наблюдали с помощью светлопольного микроскопа (BX53, Olympus).
Клетки HeLa выращивали в среде DMEM с добавлением 10% FBS во влажном инкубаторе при 37°C и 5% CO2.Клетки обрабатывали 100 мкМ KAND 11, кумамонамиковой кислотой 6, кумамонамидом 1, 100 нг/мл колцемида (Gibco) или 100 нг/мл Nocodmaze (Sigma) в течение 6 ч при 37°C.Клетки фиксировали МетОНом в течение 10 мин, а затем ацетатом в течение 5 мин при комнатной температуре.Фиксированные клетки инкубировали с первичным антителом к β-тубулину (1D4A4, Proteintech: 66240-1), разведенным в 0,5% BSA/PBS, в течение 2 часов, промывали 3 раза TBST, а затем инкубировали с козьим антителом Alexa Fluor.488 1 час.– Мышиный IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) и 15 нг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), разведенного в 0,5% BSA/PBS.После трехкратной промывки TBST окрашенные клетки наблюдали на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse Ti-E.Изображения были сняты с помощью охлаждаемой ПЗС-камеры Hamamatsu ORCA-R2 с использованием программного обеспечения MetaMorph (Molecular Devices).
Время публикации: 17 июня 2024 г.