Спасибо за посещение Nature.com. Версия браузера, которую вы используете, имеет ограниченную поддержку CSS. Для достижения наилучших результатов мы рекомендуем вам использовать более новую версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В то же время, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы показываем сайт без стилей и JavaScript.
Открытие и полезное использование натуральных продуктов может помочь улучшить жизнь человека. Ингибирующие рост растений химикаты широко используются в качестве гербицидов для борьбы с сорняками. В связи с необходимостью использования различных типов гербицидов существует необходимость в выявлении соединений с новыми механизмами действия. В этом исследовании мы обнаружили новое соединение N-алкоксипиррола, кумамонамид, из Streptomyces werraensis MK493-CF1 и установили полный процесс синтеза. С помощью анализов биологической активности мы обнаружили, что урс-моноамидовая кислота является синтетическим промежуточным продуктом урс-моноамида и потенциальнымингибитор роста растений. Кроме того, мы разработали различные производные урбеноновой кислоты, включая урбенилоксипроизводное (UDA), которое обладает высокой гербицидной активностью, не оказывая отрицательного влияния на рост клеток HeLa. Мы также обнаружили, что производные урмотоновой кислоты разрушают растительные микротрубочки; кроме того, KAND влияет на актиновые филаменты и вызывает гибель клеток; Эти многогранные эффекты отличаются от эффектов известных ингибиторов микротрубочек и предполагают новый механизм действия урсоновой кислоты, что представляет собой важное преимущество при разработке новых гербицидов.
Открытие и практическое применение полезных природных продуктов и их производных является средством улучшения качества жизни человека. Вторичные метаболиты, вырабатываемые микроорганизмами, растениями и насекомыми, привели к крупным достижениям в медицине и сельском хозяйстве. Многие антибиотики и противолейкозные препараты были разработаны из природных продуктов. Кроме того, различные типыпестициды, фунгициды и гербициды извлекаются из этих натуральных продуктов для использования в сельском хозяйстве. В частности, гербициды для борьбы с сорняками являются важными инструментами для повышения урожайности сельскохозяйственных культур в современном сельском хозяйстве, и различные типы соединений уже используются в коммерческих целях. Несколько клеточных процессов в растениях, такие как фотосинтез, метаболизм аминокислот, синтез клеточной стенки, регуляция митоза, сигнализация фитогормонов или синтез белка, считаются типичными целями гербицидов. Соединения, которые подавляют функцию микротрубочек, являются распространенным классом гербицидов, которые влияют на рост растений, влияя на митотическую регуляцию2.
Микротрубочки являются компонентами цитоскелета и широко распространены в эукариотических клетках. Гетеродимер тубулина состоит из α-тубулина и β-тубулина, образующих линейные протофиламенты микротрубочек, при этом 13 протофиламентов образуют цилиндрическую структуру. Микротрубочки играют множество ролей в растительных клетках, включая определение формы клетки, деление клетки и внутриклеточный транспорт3,4. Растительные клетки содержат микротрубочки под интерфазной плазматической мембраной, и эти так называемые кортикальные микротрубочки, как полагают, контролируют организацию микрофибрилл целлюлозы посредством регуляции комплексов целлюлозосинтазы4,5. Кортикальные микротрубочки эпидермальных клеток корня, присутствующие в зоне быстрого удлинения кончика корня, расположены латерально, а микроволокна целлюлозы следуют за этими микротрубочками и ограничивают направление расширения клетки, тем самым способствуя анизотропному удлинению клетки. Таким образом, функция микротрубочек тесно связана с морфологией растения. Замены аминокислот в генах, кодирующих тубулин, вызывают перекос кортикальных микротрубочковых массивов и лево- или правосторонний рост у Arabidopsis 6,7. Аналогичным образом мутации в белках, связанных с микротрубочками, которые регулируют динамику микротрубочек, также могут приводить к искаженному росту корней8,9,10,11,12,13. Кроме того, обработка гербицидами, разрушающими микротрубочки, такими как дизопирамид, также известный как претилахлор, также вызывает левосторонний косой рост корней14. Эти данные указывают на то, что точная регуляция функции микротрубочек имеет решающее значение для определения направления роста растений.
Были обнаружены различные типы ингибиторов микротрубочек, и эти препараты внесли значительный вклад в исследования цитоскелета, а также в сельское хозяйство и медицину2. В частности, оризалин, динитроанилиновые соединения, дизопирамид, бензамид-родственные соединения и их аналоги могут подавлять функцию микротрубочек и тем самым подавлять рост растений. Поэтому они широко используются в качестве гербицидов. Однако, поскольку микротрубочки являются важным компонентом растительных и животных клеток, большинство ингибиторов микротрубочек цитотоксичны для обоих типов клеток. Поэтому, несмотря на их признанную полезность в качестве гербицидов, ограниченное число антимикротрубочковых агентов используется в практических целях.
Streptomyces — род семейства Streptomyces, включающего аэробные, грамположительные, нитчатые бактерии, широко известный своей способностью продуцировать широкий спектр вторичных метаболитов. Поэтому он считается одним из важнейших источников новых биологически активных натуральных продуктов. В текущем исследовании мы обнаружили новое соединение, называемое кумамонамидом, которое было выделено из Streptomyces werraensis MK493-CF1 и S. werraensis ISP 5486. С помощью спектрального анализа и полного спектрального анализа была охарактеризована структура кумамонамида и определен его уникальный скелет N-алкоксипиррола. синтез. Было обнаружено, что урсмоновая кислота, синтетическое промежуточное вещество урсмоноамида и его производных, подавляет рост и прорастание популярного модельного растения Arabidopsis thaliana. В исследовании взаимосвязи структуры и активности мы обнаружили, что соединение с C9, модифицированным до урсоновой кислоты, называемое нонилоксипроизводным урсоновой кислоты (KAND), значительно усиливает ингибирующее действие на рост и прорастание. Примечательно, что недавно обнаруженный ингибитор роста растений также повлиял на рост табака и печеночника и не был цитотоксичным для бактерий или клеток HeLa. Более того, некоторые производные урмотоновой кислоты вызывают искаженный фенотип корня, подразумевая, что эти производные напрямую или косвенно влияют на микротрубочки. В соответствии с этой идеей наши наблюдения за микротрубочками, маркированными либо иммуногистохимически, либо флуоресцентными белками, указывают на то, что обработка KAND деполимеризует микротрубочки. Кроме того, обработка производными кумамотоновой кислоты разрушала актиновые микрофиламенты. Таким образом, мы обнаружили новый ингибитор роста растений, уникальный механизм действия которого включает разрушение цитоскелета.
Штамм MK493-CF1 был выделен из почвы в Shinagawa-ku, Токио. Штамм MK493-CF1 образовал хорошо разветвленный стромальный мицелий. Была определена частичная последовательность гена рибосомальной РНК 16S (1422 п.н.). Этот штамм очень похож на S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 п.н., T: типичный штамм, 99,93%). На основании этого результата было определено, что этот штамм тесно связан с типовым штаммом S. werraensis. Поэтому мы временно назвали этот штамм S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T также производит те же биоактивные соединения. Поскольку на раннем этапе было мало исследований по получению натуральных продуктов из этого микроорганизма, были проведены дополнительные химические исследования. После выращивания S. werraensis MK493-CF1 на ячменной среде методом твердофазной ферментации при 30°C в течение 14 дней, среда была экстрагирована 50% EtOH. 60 мл образца было высушено для получения 59,5 мг сырого экстракта. Сырой экстракт был подвергнут обращенно-фазовой ВЭЖХ для получения N-метокси-1H-пиррол-2-карбоксамида (1, названного кумамонамидом, 36,0 мг). Общее количество 1 составляет приблизительно 60% сырого экстракта. Поэтому мы решили подробно изучить свойства кумамотоамида 1.
Coumamonamide 1 представляет собой белый аморфный порошок, и масс-спектрометрия высокого разрешения (HRESIMS) подтверждает C6H8N2O2 (рис. 1). C2-замещенный пиррольный фрагмент этого соединения характеризуется δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Гц, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH в спектре 1H ЯМР: 4,5 Гц, H-5) и δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Гц, H-6), а спектр 13C ЯМР показывает наличие четырех атомов углерода sp2. Наличие амидной группы в положении C2 оценивалось с помощью корреляции HMBC от протона C-3 до углерода амидной карбонилгруппы при δC 161,1. Кроме того, пики ЯМР 1 H и 13 C при δH 4,10 (3H, S) и δC 68,3 указывают на присутствие N-метоксигрупп в молекуле. Хотя правильное положение метоксигруппы еще не было определено с помощью спектроскопического анализа, такого как усиленная разностная спектроскопия и ядерная аббревиатура Оверхаузера (NOEDF), N-метокси-1H-пиррол-2-карбоксамид стал первым соединением-кандидатом.
Для определения правильной структуры 1 был выполнен полный синтез (рис. 2а). Обработка коммерчески доступного 2-аминопиридина 2 с помощью m-CPBA привела к получению соответствующего N-оксида 3 с количественным выходом. После 2-аминоазидирования 2 реакция циклоконденсации, описанная Абрамовичем, была проведена в бензоле при 90°C для получения желаемого 1-гидрокси-1H-пиррол-2-карбонитрила 5 в граммах. Скорость 60% (две стадии). 15,16. Затем метилирование и гидролиз 4 дали 1-метокси-1H-пиррол-2-карбоновую кислоту (называемую «кумотоновой кислотой», 6) с хорошим выходом (70%, две стадии). Наконец, амидирование через промежуточный хлорангидрид кислоты 6 с использованием водного аммиака дало амид Кумамото 1 с выходом 98%. Все спектральные данные синтезированного 1 были аналогичны выделенному 1, поэтому структура 1 была определена;
Общий синтез и анализ биологической активности урбенамида и урбеновой кислоты. (a) Полный синтез амида Кумамото. (b) Семидневные проростки Arabidopsis Columbia (Col) дикого типа выращивали на чашках Мурасиге и Скуга (MS), содержащих кумамонамид 6 или кумамонамид 1 в указанных концентрациях. Масштабная линейка = 1 см.
Сначала мы оценили биологическую активность урбенамида и его промежуточных продуктов на предмет их способности модулировать рост растений. Мы добавляли различные концентрации урсмонамида 1 или урсмоновой кислоты 6 в среду MS-агара и культивировали проростки Arabidopsis thaliana на этой среде. Эти анализы показали, что высокие концентрации (500 мкМ) 6 подавляли рост корней (рис. 2b). Затем мы создали различные производные, заменив положение N1 6, и провели на них исследования взаимосвязи структуры и активности (процесс синтеза аналогов описан в сопроводительной информации (SI)). Проростки Arabidopsis выращивали на среде, содержащей 50 мкМ производных урсоновой кислоты, и измеряли длину корней, как показано на рисунке. Как показано на рисунках 3a, b и S1, кумамокислоты имеют различную длину линейных алкоксицепей (9, 10, 11, 12 и 13) или больших алкоксицепей (15, 16 и 17) в положении N1. Производные показали значительное ингибирование роста корней. Кроме того, мы обнаружили, что применение 200 мкМ 10, 11 или 17 ингибировало прорастание (рис. 3c и S2).
Исследование связи структуры и активности амида Кумамото и родственных соединений. (a) Структура и схема синтеза аналогов. (b) Количественная оценка длины корней 7-дневных проростков, выращенных на среде MS с 50 мкМ производными кумамонамида или без них. Звездочки указывают на существенные различия с ложной обработкой (t-тест, p< 0,05). н>18. Данные показаны как среднее значение ± SD. nt означает «не тестировалось», поскольку более 50% семян не проросли. (c) Количественная оценка скорости прорастания обработанных семян, инкубированных в течение 7 дней в среде MS с 200 мкМ кумамонамида и родственными соединениями или без них. Звездочки указывают на существенные различия с ложной обработкой (критерий хи-квадрат). n=96.
Интересно, что добавление алкильных боковых цепей длиннее C9 снижало ингибирующую активность, что позволяет предположить, что соединениям, родственным кумамотоовой кислоте, требуются боковые цепи определенного размера для проявления их биологической активности.
Поскольку анализ взаимосвязи структуры и активности показал, что C9 был модифицирован до урсоновой кислоты, а нонилоксипроизводное урсоновой кислоты (далее именуемое KAND 11) было наиболее эффективным ингибитором роста растений, мы провели более подробную характеристику KAND 11. Обработка Arabidopsis 50 мкМ KAND 11 почти полностью предотвратила прорастание, тогда как более низкие концентрации (40, 30, 20 или 10 мкМ) KAND 11 ингибировали рост корней дозозависимым образом (рис. 4a, b). Чтобы проверить, влияет ли KAND 11 на жизнеспособность корневой меристемы, мы исследовали корневые меристемы, окрашенные пропидиум-йодидом (PI), и измерили размер области меристемы. Размер меристемы проростков, выращенных на среде, содержащей 25 мкМ KAND-11, составил 151,1 ± 32,5 мкм, тогда как размер меристемы проростков, выращенных на контрольной среде, содержащей ДМСО, составил 264,7 ± 30,8 мкм (рис. 4c, d), что указывает на то, что KAND-11 восстанавливает клеточную активность. распространение. Корневая меристема. В соответствии с этим, обработка KAND 11 снизила количество сигнала маркера клеточного деления CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS в корневой меристеме (рис. 4e) 17 . Эти результаты указывают на то, что KAND 11 ингибирует рост корня за счет снижения активности пролиферации клеток.
Анализ ингибирующего действия производных урбеновой кислоты (урбенилоксипроизводных) на рост. (a) 7-дневные проростки дикого типа Col, выращенные на чашках MS с указанными концентрациями KAND 11. Масштабная линейка = 1 см. (b) Количественная оценка длины корня. Буквы обозначают значимые различия (тест Tukey HSD, p< 0,05). н>16. Данные представлены как среднее значение ± SD. (c) Конфокальная микроскопия окрашенных пропидиум-йодидом корней дикого типа Col, выращенных на чашках MS с 25 мкМ KAND 11 или без него. Белые скобки обозначают корневую меристему. Масштабная линейка = 100 мкм. (d) Количественная оценка размера корневой меристемы (n = 10–11). Статистические различия определялись с помощью t-критерия (p< 0,05). Столбцы представляют средний размер меристемы. (e) Дифференциально-интерференционная контрастная микроскопия (ДИК) корневой меристемы, содержащей конструкцию CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS, окрашенная и окрашенная на 5-дневных проростках, выращенных на чашках MS с анализом 25 мкМ KAND или без него.
Фитотоксичность KAND 11 была дополнительно протестирована с использованием другого двудольного растения, табака (Nicotiana tabacum), и основного модельного организма наземного растения, печеночника (Marchantia polymorpha). Как и в случае с Arabidopsis, саженцы табака SR-1, выращенные на среде, содержащей 25 мкМ KAND 11, дали более короткие корни (рис. 5a). Кроме того, 40 из 48 семян проросли на чашках, содержащих 200 мкМ KAND 11, тогда как все 48 семян проросли на средах, обработанных имитацией, что указывает на то, что более высокие концентрации KAND были значительными (p< 0,05; хи-квадрат) подавлял прорастание табака. (рис. 5b). Кроме того, концентрация KAND 11, которая подавляла рост бактерий в печеночнике, была аналогична эффективной концентрации в Arabidopsis (рис. 5c). Эти результаты указывают на то, что KAND 11 может подавлять рост различных растений. Затем мы исследовали возможную цитотоксичность соединений, связанных с медвежьим моноамидом, в других организмах, а именно в клетках человека HeLa и штамме Escherichia coli DH5α, как представителей высших животных и бактериальных клеток соответственно. В серии анализов пролиферации клеток мы наблюдали, что кумамонамид 1, кумамонамидовая кислота 6 и KAND 11 не влияли на рост клеток HeLa или E. coli в концентрациях 100 мкМ (рис. 5d,e).
Ингибирование роста KAND 11 в организмах, не являющихся Arabidopsis. (a) Двухнедельные саженцы табака дикого типа SR-1 выращивали на вертикально расположенных чашках MS, содержащих 25 мкМ KAND 11. (b) Двухнедельные саженцы табака дикого типа SR-1 выращивали на горизонтально расположенных чашках MS, содержащих 200 мкМ KAND 11. (c) Двухнедельные почки печеночника дикого типа Tak-1, выращенные на чашках Gamborg B5 с указанными концентрациями KAND 11. Красные стрелки указывают на споры, которые прекратили рост в течение двухнедельного периода инкубации. (d) Анализ пролиферации клеток HeLa. Количество жизнеспособных клеток измеряли через фиксированные интервалы времени с помощью набора для подсчета клеток 8 (Dojindo). В качестве контроля клетки HeLa обрабатывали 5 мкг/мл актиномицина D (Act D), который ингибирует транскрипцию РНК-полимеразы и вызывает гибель клеток. Анализы проводились в трех повторностях. (e) Анализ пролиферации клеток E. coli. Рост E. coli анализировали путем измерения OD600. В качестве контроля клетки обрабатывали 50 мкг/мл ампициллина (Amp), который ингибирует синтез бактериальной клеточной стенки. Анализы проводились в трех повторностях.
Чтобы расшифровать механизм действия цитотоксичности, вызванной соединениями, родственными урамиду, мы повторно проанализировали производные урбеновой кислоты с умеренным ингибирующим эффектом, как показано на рисунке. Как показано на рисунках 2b, 6a, проростки, выращенные на агаровых пластинах, содержащих высокие концентрации (200 мкМ) урмотоновой кислоты 6, давали более короткие и изогнутые влево корни (θ = – 23,7 ± 6,1), тогда как проростки, выращенные на контрольной среде, давали почти прямые корни (θ = – 3,8 ± 7,1). Известно, что этот характерный наклонный рост является результатом дисфункции кортикальных микротрубочек14,18. В соответствии с этим выводом, дестабилизирующие микротрубочки препараты дизопирамид и оризалин вызывали схожий наклон корней в наших условиях роста (рис. 2b, 6a). В то же время мы протестировали производные урмотоновой кислоты и выбрали несколько из них, которые при определенных концентрациях вызывали наклонный рост корней. Соединения 8, 9 и 15 изменяли направление роста корней при 75 мкМ, 50 мкМ и 40 мкМ соответственно, что указывает на то, что эти соединения могут эффективно дестабилизировать микротрубочки (рис. 2b, 6a). Мы также протестировали наиболее сильное производное урсоловой кислоты, KAND 11, при более низкой концентрации (15 мкМ) и обнаружили, что применение KAND 11 ингибировало рост корней и что направление роста корней было неравномерным, хотя они имели тенденцию к наклону влево (рисунок C3). . Поскольку более высокие концентрации препаратов, дестабилизирующих микротрубочки, иногда ингибируют рост растений, а не вызывают наклон корней, мы впоследствии оценили возможность того, что KAND 11 влияет на микротрубочки, наблюдая за кортикальными микротрубочками в эпидермальных клетках корней. Иммуногистохимия с использованием антител против β-тубулина в эпидермальных клетках корней проростков, обработанных 25 мкМ KAND 11, показала исчезновение почти всех кортикальных микротрубочек в эпидермальных клетках в зоне удлинения (рис. 6b). Эти результаты указывают на то, что кумамотоновая кислота и ее производные действуют прямо или косвенно на микротрубочки, разрушая их, и что эти соединения являются новыми ингибиторами микротрубочек.
Урсоновая кислота и ее производные изменяют кортикальные микротрубочки Arabidopsis thaliana. (a) Угол наклона корня, измеренный в присутствии различных производных урмотоновой кислоты в указанных концентрациях. Также были проанализированы эффекты двух соединений, известных как ингибирующие микротрубочки: дизопирамида и оризалина. На вставке показан стандарт, используемый для измерения угла роста корня. Звездочки указывают на существенные различия с ложной обработкой (t-тест, p< 0,05). н>19. Масштабная линейка = 1 см. (b) Кортикальные микротрубочки в эпидермальных клетках в зоне удлинения. Микротрубочки в корнях Arabidopsis Col дикого типа, выращенных на чашках MS с добавлением или без добавления 25 мкМ KAND 11, визуализировались с помощью иммуногистохимического окрашивания с использованием первичных антител к β-тубулину и вторичных антител, конъюгированных с Alexa Fluor. Масштабная линейка = 10 мкм. (c) Митотическая структура микротрубочек в меристеме корня. Микротрубочки визуализировались с помощью иммуногистохимического окрашивания. Митотические структуры, включая зоны профазы, веретена и фрагмопласты, подсчитывались на конфокальных изображениях. Стрелки указывают на митотические структуры микротрубочек. Звездочки указывают на существенные различия при ложной обработке (t-тест, p< 0,05). н>9. Масштабная линейка = 50 мкм.
Хотя Ursa обладает способностью нарушать функцию микротрубочек, ожидается, что механизм его действия будет отличаться от типичных агентов, деполимеризующих микротрубочки. Например, более высокие концентрации агентов, деполимеризующих микротрубочки, таких как дизопирамид и оризалин, вызывают анизотропное расширение эпидермальных клеток, тогда как KAND 11 этого не делает. Кроме того, совместное применение KAND 11 и дизопирамида привело к комбинированной реакции роста корней, вызванной дизопирамидом, и было отмечено ингибирование роста, вызванное KAND 11 (рис. S4). Мы также проанализировали реакцию сверхчувствительного мутанта дизопирамида 1-1 (phs1-1) на KAND 11. phs1-1 имеет неканоническую точечную мутацию тубулинкиназы и производит более короткие корни при обработке дизопирамидом9,20. У проростков мутанта phs1-1, выращенных на агаризованной среде, содержащей KAND 11, были более короткие корни, похожие на корни, выращенные на дизопирамиде (рис. S5).
Кроме того, мы наблюдали структуры митотических микротрубочек, такие как профазные зоны, веретена и фрагмопласты, в корневой меристеме проростков, обработанных KAND 11. В соответствии с наблюдениями для CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, наблюдалось значительное уменьшение количества митотических микротрубочек (рис. 6c).
Чтобы охарактеризовать цитотоксичность KAND 11 на субклеточном уровне, мы обработали суспензионные клетки табака BY-2 KAND 11 и наблюдали за их реакцией. Сначала мы добавили KAND 11 к клеткам BY-2, экспрессирующим TagRFP-TUA6, который флуоресцентно маркирует микротрубочки, чтобы оценить влияние KAND 11 на кортикальные микротрубочки. Плотность кортикальных микротрубочек оценивали с помощью анализа изображений, который количественно определял процент цитоскелетных пикселей среди цитоплазматических пикселей. Результаты анализа показали, что после обработки 50 мкМ или 100 мкМ KAND 11 в течение 1 часа плотность значительно снизилась до 0,94 ± 0,74% или 0,23 ± 0,28% соответственно, в то время как плотность клеток, обработанных ДМСО, составила 1,61 ± 0,34% (рис. 7а). Эти результаты согласуются с наблюдением, полученным на Arabidopsis, что обработка KAND 11 вызывает деполимеризацию кортикальных микротрубочек (рис. 6b). Мы также исследовали линию BY-2 с актиновыми филаментами, мечеными GFP-ABD, после обработки той же концентрацией KAND 11 и наблюдали, что обработка KAND 11 разрушала актиновые филаменты. Обработка 50 мкМ или 100 мкМ KAND 11 в течение 1 ч значительно снижала плотность актиновых филаментов до 1,20 ± 0,62% или 0,61 ± 0,26% соответственно, тогда как плотность в клетках, обработанных ДМСО, составляла 1,69 ± 0,51% (рис. 2). 7b). Эти результаты контрастируют с эффектами пропизамида, который не влияет на актиновые филаменты, и латрункулина B, деполимеризатора актина, который не влияет на микротрубочки (SI Рисунок S6). Кроме того, обработка кумамонамидом 1, кумамонамидной кислотой 6 или KAND 11 не повлияла на микротрубочки в клетках HeLa (SI Рисунок S7). Таким образом, считается, что механизм действия KAND 11 отличается от механизма действия известных разрушителей цитоскелета. Кроме того, наше микроскопическое наблюдение за клетками BY-2, обработанными KAND 11, выявило начало гибели клеток во время обработки KAND 11 и показало, что доля мертвых клеток, окрашенных синим Эвансом, существенно не увеличилась после 30 минут обработки KAND 11, тогда как после 90 минут обработки 50 мкМ или 100 мкМ KAND количество мертвых клеток увеличилось до 43,7% или 80,1% соответственно (рис. 7c). В совокупности эти данные указывают на то, что новое производное урсоловой кислоты KAND 11 является специфичным для растений ингибитором цитоскелета с ранее неизвестным механизмом действия.
KAND влияет на кортикальные микротрубочки, актиновые филаменты и жизнеспособность клеток табака BY-2. (a) Визуализация кортикальных микротрубочек в клетках BY-2 в присутствии TagRFP-TUA6. Клетки BY-2, обработанные KAND 11 (50 мкМ или 100 мкМ) или ДМСО, исследовали с помощью конфокальной микроскопии. Плотность кортикальных микротрубочек рассчитывали по микрофотографиям 25 независимых клеток. Буквы обозначают значимые различия (тест Тьюки HSD, p< 0,05). Масштабная линейка = 10 мкм. (b) Кортикальные актиновые филаменты в клетках BY-2, визуализированные в присутствии GFP-ABD2. Клетки BY-2, обработанные KAND 11 (50 мкМ или 100 мкМ) или ДМСО, исследовали с помощью конфокальной микроскопии. Плотность кортикальных актиновых филаментов рассчитывали по микрофотографиям 25 независимых клеток. Буквы обозначают значимые различия (тест Тьюки HSD, p< 0,05). Масштабная линейка = 10 мкм. (c) Наблюдение за мертвыми клетками BY-2 с помощью окрашивания синим Эвансом. Клетки BY-2, обработанные KAND 11 (50 мкМ или 100 мкМ) или ДМСО, исследовали с помощью светлопольной микроскопии. n=3. Масштабная линейка = 100 мкм.
Открытие и применение новых натуральных продуктов привело к значительному прогрессу в различных аспектах жизни человека, включая медицину и сельское хозяйство. Исторические исследования проводились для получения полезных соединений из природных ресурсов. В частности, известно, что актиномицеты полезны в качестве противопаразитарных антибиотиков для нематод из-за их способности производить различные вторичные метаболиты, такие как авермектин, ведущее соединение ивермектина и блеомицина и его производных, используемых в медицине в качестве противоракового средства21,22. Аналогичным образом, из актиномицетов были обнаружены различные гербицидные соединения, некоторые из которых уже используются в коммерческих целях1,23. Поэтому анализ метаболитов актиномицетов для выделения натуральных продуктов с желаемой биологической активностью считается эффективной стратегией. В этом исследовании мы обнаружили новое соединение, кумамонамид, из S. werraensis и успешно синтезировали его. Урсоновая кислота является синтетическим промежуточным продуктом урбенамида и его производных. Он может вызывать характерное скручивание корней, проявлять гербицидную активность от умеренной до сильной и напрямую или косвенно повреждать микротрубочки растений. Однако механизм действия урмотоновой кислоты может отличаться от механизма действия существующих ингибиторов микротрубочек, поскольку KAND 11 также разрушает актиновые филаменты и вызывает гибель клеток, что предполагает регуляторный механизм, посредством которого урмотоновая кислота и ее производные влияют на широкий спектр структур цитоскелета.
Дальнейшая подробная характеристика урбеноновой кислоты поможет лучше понять механизм действия урбеноновой кислоты. В частности, следующей целью является оценка способности урсоновой кислоты связываться с восстановленными микротрубочками, чтобы определить, действуют ли урсоновая кислота и ее производные непосредственно на микротрубочки и деполимеризуют их, или их действие приводит к дестабилизации микротрубочек. Кроме того, в случае, когда микротрубочки не являются прямой мишенью, определение места действия и молекулярных мишеней урсоновой кислоты на растительных клетках поможет глубже понять свойства родственных соединений и возможные пути улучшения гербицидной активности. Наш анализ биоактивности выявил уникальную цитотоксическую способность урсоновой кислоты на рост растений, таких как Arabidopsis thaliana, табак и печеночник, при этом ни клетки E. coli, ни клетки HeLa не были затронуты. Незначительная или нулевая токсичность для клеток животных является преимуществом производных урсоновой кислоты, если они разрабатываются в качестве гербицидов для использования на открытых сельскохозяйственных полях. Действительно, поскольку микротрубочки являются обычными структурами у эукариот, их селективное ингибирование в растениях является ключевым требованием для гербицидов. Например, пропизамид, деполимеризующий микротрубочки агент, который напрямую связывается с тубулином и ингибирует полимеризацию, используется в качестве гербицида из-за его низкой токсичности для клеток животных24. В отличие от дизопирамида, родственные бензамиды имеют другую целевую специфичность. Помимо растительных микротрубочек, RH-4032 или бензоксамид также ингибирует микротрубочки клеток животных или оомицетов соответственно, а залиламид используется в качестве фунгицида из-за его низкой фитотоксичности25,26,27. Недавно обнаруженный медведь и его производные проявляют селективную цитотоксичность против растений, но стоит отметить, что дальнейшие модификации могут изменить их целевую специфичность, потенциально предоставляя дополнительные производные для контроля патогенных грибов или оомицетов.
Уникальные свойства урбеноновой кислоты и ее производных полезны для их разработки в качестве гербицидов и использования в качестве исследовательских инструментов. Важность цитоскелета в контроле формы растительных клеток широко признана. Более ранние исследования показали, что растения развили сложные механизмы организации кортикальных микротрубочек путем контроля динамики микротрубочек для надлежащего контроля морфогенеза. Было идентифицировано большое количество молекул, ответственных за регуляцию активности микротрубочек, и соответствующие исследования все еще продолжаются3,4,28. Наше текущее понимание динамики микротрубочек в растительных клетках не полностью объясняет механизмы организации кортикальных микротрубочек. Например, хотя и дизопирамид, и оризалин могут деполимеризовать микротрубочки, дизопирамид вызывает серьезную деформацию корней, в то время как оризалин оказывает относительно слабое действие. Более того, мутации в тубулине, который стабилизирует микротрубочки, также вызывают правовращательное движение в корнях, тогда как паклитаксел, который также стабилизирует динамику микротрубочек, этого не делает. Таким образом, изучение и идентификация молекулярных мишеней урсоловой кислоты должны дать новое понимание регуляции кортикальных микротрубочек растений. Аналогично, будущие сравнения химических веществ, которые эффективны в содействии искаженному росту, таких как дизопирамид, и менее эффективных химических веществ, таких как оризалин или кумамоторная кислота, дадут подсказки о том, как происходит искаженный рост.
С другой стороны, перестройки цитоскелета, связанные с защитой, являются еще одной возможностью объяснить цитотоксичность урсоновой кислоты. Инфицирование патогеном или введение элиситора в растительные клетки иногда вызывает разрушение цитоскелета и последующую гибель клеток29. Например, сообщалось, что криптоксантин, полученный из оомицетов, разрушает микротрубочки и актиновые филаменты до гибели клеток табака, подобно тому, что происходит при обработке KAND30,31. Сходство между защитными реакциями и клеточными реакциями, вызванными урсоновой кислотой, привело нас к гипотезе, что они запускают общие клеточные процессы, хотя очевиден более быстрый и сильный эффект урсоновой кислоты, чем криптоксантина. Однако исследования показали, что разрушение актиновых филаментов способствует спонтанной гибели клеток, которая не всегда сопровождается разрушением микротрубочек29. Кроме того, еще предстоит выяснить, вызывает ли патоген или элиситор искаженный рост корней, как это делают производные урсоновой кислоты. Таким образом, молекулярные знания, связывающие защитные реакции и цитоскелет, являются привлекательной проблемой для решения. Используя наличие низкомолекулярных соединений, связанных с урсоновой кислотой, а также ряд производных с различной эффективностью, они могут предоставить возможности для нацеливания на неизвестные клеточные механизмы.
В совокупности открытие и применение новых соединений, модулирующих динамику микротрубочек, предоставит мощные методы для решения сложных молекулярных механизмов, лежащих в основе определения формы растительной клетки. В этом контексте недавно разработанное соединение урмотоновая кислота, которое влияет на микротрубочки и актиновые филаменты и вызывает гибель клеток, может предоставить возможность расшифровать связь между контролем микротрубочек и этими другими механизмами. Таким образом, химический и биологический анализ с использованием урбеновой кислоты поможет нам понять молекулярные регуляторные механизмы, которые контролируют цитоскелет растения.
Инокулируйте S. werraensis MK493-CF1 в колбу Эрленмейера с перегородкой объемом 500 мл, содержащую 110 мл посевной среды, состоящей из 2% (w/v) галактозы, 2% (w/v) пасты Essence, 1% (w/v) Bacto-состава. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) кукурузного экстракта (KOGOSTCH Co., Ltd., Япония), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 и 0,2% CaCO3 в деионизированной воде. (pH 7,4 перед стерилизацией). Посевные культуры инкубировали на роторном шейкере (180 об/мин) при 27 °C в течение 2 дней. Производственное выращивание с помощью твердофазной ферментации. Посевную культуру (7 мл) переносили в колбу К-1 объемом 500 мл, содержащую 40 г производственной среды, состоящей из 15 г прессованного ячменя (MUSO Co., Ltd., Япония) и 25 г деионизированной воды (pH не регулировали перед стерилизацией). Ферментацию проводили при 30°C в темноте в течение 14 дней. Ферментируемый материал экстрагировали 40 мл/бутылку EtOH и центрифугировали (1500 g, 4°C, 10 мин). Культуральный супернатант (60 мл) экстрагировали смесью 10% MeOH/EtOAc. Органический слой упаривали при пониженном давлении с получением остатка (59,5 мг), который подвергали ВЭЖХ с градиентным элюированием (0–10 минут: 90%) на обращенно-фазовой колонке (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 мкм, ID 10 мм × длина 250 мм) H2O/CH3CN, 10–35 минут: 90% H2O/CH3CN до 70% H2O/CH3CN (градиент), 35–45 минут: 90% H2O/EtOH, 45–155 минут: 90% H2O/EtOH до 100% EtOH (градиент (градиент), 155–200 мин: 100% EtOH) при скорости потока 1,5 мл/мин, кумамонамид (1, 36,0 мг) выделяли в виде белого аморфного порошка.
Кумамотоамид(1); 1H-ЯМР (500 МГц, CDCl3) δ 6,93 (т, J = 2,5 Гц, 1H), 6,76 (дд, J = 4,3, 1,8 Гц 1H), 6,05 (т , J = 3,8 Гц, 1H). ), 4,08 (с, 3H); 13C-ЯМР (125 МГц, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ расчетное значение: 141,0659, измеренное значение: 141,0663, ИК νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 см–1.
Семена сорта Columbia (Col-0) были получены из Центра биологических ресурсов Arabidopsis (ABRC) с разрешения на использование в исследовательских целях. Семена сорта Col-0 были размножены и сохранены в наших лабораторных условиях и использовались как растения Arabidopsis дикого типа. Семена Arabidopsis были поверхностно стерилизованы и культивированы в среде Мурасиге и Скуга половинной концентрации, содержащей 2% сахарозы (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) и 1,5% агара (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, при 23 °C и постоянном освещении. Семена мутанта phs1-1 были предоставлены Т. Хашимото (Институт науки и технологий Нары).
Семена штамма SR-1 были предоставлены T. Hashimoto (Институт науки и технологий Нары) и использовались в качестве растений табака дикого типа. Семена табака были поверхностно стерилизованы и замочены в стерильной воде на три ночи для ускорения прорастания, затем помещены в раствор половинной крепости, содержащий 2% сахарозы, 0,05% (w/v) MES и 0,8% геллановой камеди (среда Мурасиге и Скуга Fujifilm Wako Pure Chemical) с pH 5,7 и инкубированы при 23°C при постоянном освещении.
Штамм Tak-1 был предоставлен T. Kohchi (Университет Киото) и использовался в качестве стандартной экспериментальной единицы для исследования печеночников. Gemma была получена из стерилизованных культивируемых растений, а затем высеяна на среду Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical), содержащую 1% сахарозы и 0,3% геллановой камеди, и инкубирована при 23°C при постоянном освещении.
Клетки табака BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) были предоставлены S. Hasezawa (Университет Токио). Клетки BY-2 были разбавлены в 95 раз в модифицированной среде Линсмейера и Скуга и еженедельно дополнены 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой 32 . Клеточную суспензию перемешивали на роторном шейкере при 130 об/мин при 27°C в темноте. Промыли клетки 10-кратным объемом свежей среды и ресуспендировали в той же среде. Трансгенные клеточные линии BY-2, стабильно экспрессирующие маркер микротрубочек TagRFP-TUA6 или маркер актиновых филаментов GFP-ABD2 под промотором вируса мозаики цветной капусты 35S, были получены, как описано33,34,35. Эти клеточные линии можно поддерживать и синхронизировать с помощью процедур, аналогичных тем, которые использовались для исходной клеточной линии BY-2.
Клетки HeLa культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM) (Life Technologies) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 1,2 ЕД/мл пенициллина и 1,2 мкг/мл стрептомицина в инкубаторе при температуре 37°C с 5% CO2.
Все эксперименты, описанные в данной рукописи, проводились в соответствии с японскими правилами и рекомендациями по биологической безопасности.
Соединения растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО; Fujifilm Wako Pure Chemical) в виде исходных растворов и разбавляли в среде MS для Arabidopsis и табака или среде Gamborg B5 для печеночника. Для анализа ингибирования роста корней более 10 семян на чашку высевали на агаризованную среду, содержащую указанные соединения или ДМСО. Семена инкубировали в камере роста в течение 7 дней. Сеянцы фотографировали и измеряли длину корней. Для анализа прорастания Arabidopsis 48 семян на чашку высевали на агаризованную среду, содержащую 200 мкМ соединения или ДМСО. Семена Arabidopsis выращивали в камере роста, и количество проросших сеянцев подсчитывали через 7 дней после прорастания (dag). Для анализа прорастания табака 24 семени на чашку высевали на агаризованную среду, содержащую 200 мкМ KAND или ДМСО. Семена табака выращивали в камере роста, и количество проросших сеянцев подсчитывали через 14 дней. Для анализа ингибирования роста печеночника 9 эмбрионов с каждой чашки высевали на агаровую среду, содержащую указанные концентрации KAND или DMSO, и инкубировали в камере роста в течение 14 дней.
Используйте проростки, окрашенные 5 мг/мл пропидиум иодидом (PI), для визуализации организации корневой меристемы. Сигналы PI наблюдались с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа TCS SPE (Leica Microsystems).
Гистохимическое окрашивание корней β-глюкуронидазой (GUS) проводили в соответствии с протоколом, описанным Малами и Бенфеем36. Сеянцы фиксировали в 90% ацетоне в течение ночи, окрашивали 0,5 мг/мл 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-d-глюкуроновой кислотой в буфере GUS в течение 1 часа и помещали в гидратированный раствор хлоральдегида. (8 г хлоралгидрата, 2 мл воды и 1 мл глицерина) и наблюдали с помощью дифференциальной интерференционной контрастной микроскопии с использованием микроскопа Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Углы корней измеряли на 7-дневных сеянцах, выращенных на вертикально расположенных пластинах. Измерьте угол корня от направления вектора силы тяжести, как описано в шаге 6.
Расположение кортикальных микротрубочек наблюдалось, как описано, с небольшими изменениями в протоколе 37 . Антитело к β-тубулину (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) и конъюгированное с Alexa Fluor 488 антимышиное IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) использовались в качестве первичных и вторичных антител в разведениях 1:1000 и 1:100 соответственно. Флуоресцентные изображения были получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа TCS SPE (Leica Microsystems). Получите изображения Z-stack и создайте проекции максимальной интенсивности в соответствии с инструкциями производителя.
Анализ пролиферации клеток HeLa проводился с использованием набора для подсчета клеток Cell Counting Kit 8 (Dojindo) в соответствии с инструкциями производителя.
Рост E. coli DH5α анализировали путем измерения плотности клеток в культуре с использованием спектрофотометра при 600 нм (OD600).
Организация цитоскелета в трансгенных клетках BY-2 наблюдалась с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного конфокальным сканирующим устройством CSU-X1 (Yokogawa) и камерой sCMOS (Zyla, Andor Technology). Плотность цитоскелета оценивалась с помощью анализа изображений, который количественно определял процент пикселей цитоскелета среди цитоплазматических пикселей на конфокальных изображениях с использованием программного обеспечения ImageJ, как описано38,39.
Для обнаружения гибели клеток в клетках BY-2 аликвоту клеточной суспензии инкубировали с 0,05% синим Эвансом в течение 10 минут при комнатной температуре. Селективное окрашивание синим Эвансом мертвых клеток зависит от вытеснения красителя из жизнеспособных клеток неповрежденной плазматической мембраной40. Окрашенные клетки наблюдали с помощью микроскопа со светлым полем (BX53, Olympus).
Клетки HeLa выращивали в среде DMEM с добавлением 10% FBS в увлажненном инкубаторе при температуре 37°C и 5% CO2. Клетки обрабатывали 100 мкМ KAND 11, кумамонамовой кислотой 6, кумамонамидом 1, 100 нг/мл колцемида (Gibco) или 100 нг/мл Nocodmaze (Sigma) в течение 6 ч при температуре 37°C. Клетки фиксировали MetOH в течение 10 мин, а затем ацетатом в течение 5 мин при комнатной температуре. Фиксированные клетки инкубировали с первичным антителом к β-тубулину (1D4A4, Proteintech: 66240-1), разведенным в 0,5% BSA/PBS, в течение 2 ч, промывали 3 раза TBST, а затем инкубировали с козьим антителом Alexa Fluor. 488 1 час. – IgG мыши (Thermo Fisher Scientific: A11001) и 15 нг/мл 4′,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), разведенного в 0,5% BSA/PBS. После трехкратной промывки TBST окрашенные клетки наблюдались на инвертированном микроскопе Nikon Eclipse Ti-E. Изображения были получены с помощью охлаждаемой камеры Hamamatsu ORCA-R2 CCD с использованием программного обеспечения MetaMorph (Molecular Devices).
Время публикации: 17 июня 2024 г.