Для эффективногоборьба с комарамиДля снижения заболеваемости переносимыми ими болезнями необходимы стратегические, устойчивые и экологически чистые альтернативы химическим пестицидам. Мы оценили муку из семян некоторых представителей семейства Brassicaceae (Brassica) в качестве источника растительных изотиоцианатов, получаемых путем ферментативного гидролиза биологически неактивных глюкозинолатов, для использования в борьбе с египетским комаром Aedes (L., 1762). Пять обезжиренных семян (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 и Thlaspi arvense – три основных типа термической инактивации и ферментативной деградации). Химические продукты. Для определения токсичности (LC50) аллил изотиоцианата, бензил изотиоцианата и 4-гидроксибензилизотиоцианата для личинок Aedes aegypti при 24-часовом воздействии = 0,04 г/120 мл dH2O). Значения LC50 для горчицы, белой горчицы и хвоща. Эффективность муки из семян люцерны составила 0,05, 0,08 и 0,05 соответственно по сравнению с аллил изотиоцианатом (LC50 = 19,35 ppm), а 4-гидроксибензилизотиоцианат (LC50 = 55,41 ppm) оказался более токсичным для личинок в течение 24 часов после обработки, чем 0,1 г/120 мл dH2O соответственно. Эти результаты согласуются с данными о производстве муки из семян люцерны. Более высокая эффективность бензиловых эфиров соответствует рассчитанным значениям LC50. Использование муки из семян может обеспечить эффективный метод борьбы с комарами. Эффективность порошка из семян крестоцветных и его основных химических компонентов против личинок комаров показана на примере того, как природные соединения в порошке из семян крестоцветных могут служить перспективным экологически чистым ларвицидом для борьбы с комарами.
Заболевания, передаваемые комарами рода Aedes, остаются серьезной глобальной проблемой общественного здравоохранения. Заболеваемость болезнями, передаваемыми комарами, распространяется географически1,2,3 и вновь возникает, приводя к вспышкам тяжелых заболеваний4,5,6,7. Распространение заболеваний среди людей и животных (например, чикунгунья, денге, лихорадка Рифт-Валли, желтая лихорадка и вирус Зика) беспрецедентно. Только лихорадка денге подвергает риску заражения около 3,6 миллиарда человек в тропиках, при этом ежегодно регистрируется около 390 миллионов случаев заражения, приводящих к 6100–24300 смертям в год8. Повторное появление и вспышка вируса Зика в Южной Америке привлекли внимание всего мира из-за повреждения головного мозга, которое он вызывает у детей, рожденных от инфицированных женщин2. Кремер и др.³ прогнозируют, что географический ареал комаров рода Aedes будет продолжать расширяться и что к 2050 году половина населения мира будет подвержена риску заражения арбовирусами, переносимыми комарами.
За исключением недавно разработанных вакцин против лихорадки денге и желтой лихорадки, вакцины против большинства заболеваний, передаваемых комарами, еще не разработаны9,10,11. Вакцины по-прежнему доступны в ограниченных количествах и используются только в клинических испытаниях. Контроль над комарами-переносчиками с помощью синтетических инсектицидов является ключевой стратегией борьбы с распространением заболеваний, передаваемых комарами12,13. Хотя синтетические пестициды эффективны в уничтожении комаров, их постоянное использование негативно влияет на нецелевые организмы и загрязняет окружающую среду14,15,16. Еще более тревожной является тенденция к увеличению устойчивости комаров к химическим инсектицидам17,18,19. Эти проблемы, связанные с пестицидами, ускорили поиск эффективных и экологически чистых альтернатив для борьбы с переносчиками болезней.
Различные растения были разработаны в качестве источников фитопестицидов для борьбы с вредителями20,21. Растительные вещества, как правило, экологически безопасны, поскольку они биоразлагаемы и обладают низкой или незначительной токсичностью для нецелевых организмов, таких как млекопитающие, рыбы и амфибии20,22. Известно, что растительные препараты производят множество биологически активных соединений с различными механизмами действия для эффективного контроля различных стадий развития комаров23,24,25,26. Соединения растительного происхождения, такие как эфирные масла и другие активные растительные ингредиенты, привлекли внимание и проложили путь к инновационным инструментам для борьбы с комарами-переносчиками. Эфирные масла, монотерпены и сесквитерпены действуют как репелленты, средства, отпугивающие насекомых от кормления, и овициды27,28,29,30,31,32,33. Многие растительные масла вызывают гибель личинок, куколок и взрослых особей комаров34,35,36, воздействуя на нервную, дыхательную, эндокринную и другие важные системы насекомых37.
Недавние исследования позволили получить представление о потенциальном использовании горчицы и ее семян в качестве источника биологически активных соединений. Горчичная мука была протестирована в качестве биофумиганта38,39,40,41 и использована в качестве почвенной добавки для подавления сорняков42,43,44 и борьбы с почвенными патогенами растений45,46,47,48,49,50, питания растений, нематодами41,51, 52, 53, 54 и вредителями55, 56, 57, 58, 59, 60. Фунгицидная активность этих порошков из семян объясняется наличием защитных соединений растений, называемых изотиоцианатами38,42,60. В растениях эти защитные соединения хранятся в растительных клетках в виде небиологически активных глюкозинолатов. Однако, когда растения повреждаются насекомыми или патогенными инфекциями, глюкозинолаты гидролизуются мирозиназой до биологически активных изотиоцианатов55,61. Изотиоцианаты — это летучие соединения, известные своим широким спектром антимикробного и инсектицидного действия, а их структура, биологическая активность и содержание значительно различаются у разных видов семейства Brassicaceae42,59,62,63.
Хотя известно, что изотиоцианаты, полученные из муки семян горчицы, обладают инсектицидной активностью, данные об их биологической активности против членистоногих переносчиков, имеющих важное медицинское значение, отсутствуют. В нашем исследовании изучалась ларвицидная активность четырех обезжиренных порошков семян против комаров рода Aedes. Целью исследования было оценить их потенциальное использование в качестве экологически чистых биопестицидов для борьбы с комарами. Также были протестированы три основных химических компонента муки семян: аллил изотиоцианат (AITC), бензил изотиоцианат (BITC) и 4-гидроксибензилизотиоцианат (4-HBITC) для проверки биологической активности этих химических компонентов на личинках комаров. Это первое исследование, оценивающее эффективность четырех порошков семян капусты и их основных химических компонентов против личинок комаров.
Лабораторные колонии комаров Aedes aegypti (штамм Рокфеллера) содержались при температуре 26°C, относительной влажности 70% и фотопериоде 10:14 ч (свет:темнота). Спаривающиеся самки содержались в пластиковых клетках (высота 11 см, диаметр 9,5 см) и кормились с помощью бутылочной системы с использованием цитратной бычьей крови (HemoStat Laboratories Inc., Диксон, Калифорния, США). Кормление кровью проводилось обычным способом с использованием мембранного многослойного стеклянного кормушки (Chemglass, Life Sciences LLC, Вайнленд, Нью-Джерси, США), соединенного с циркуляционной водяной баней (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) с контролем температуры 37°C. На дно каждой стеклянной кормушки (площадь 154 мм²) натягивали пленку Parafilm M. Затем каждую кормушку помещали на верхнюю решетку, закрывающую клетку с спаривающейся самкой. Приблизительно 350–400 мкл бычьей крови добавляли в стеклянную воронку для кормления с помощью пипетки Пастера (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), и взрослым червям давали стечь в течение как минимум одного часа. Затем беременным самкам давали 10%-ный раствор сахарозы и позволяли откладывать яйца на влажную фильтровальную бумагу, выложенную в отдельные ультрапрозрачные чашки для суфле (объемом 1,25 жидких унций, Dart Container Corp., Mason, MI, USA). Поместите фильтровальную бумагу с яйцами в герметичный пакет (SC Johnsons, Racine, WI) и храните при температуре 26°C. Яйца вылуплялись, и приблизительно 200–250 личинок выращивали в пластиковых лотках, содержащих смесь кроличьего корма (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, USA) и порошка печени (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, USA). и рыбное филе (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Германия) в соотношении 2:1:1. В наших биологических тестах использовались личинки поздней третьей стадии развития.
Семена растений, использованные в данном исследовании, были получены из следующих коммерческих и государственных источников: Brassica juncea (коричневая горчица — Pacific Gold) и Brassica juncea (белая горчица — Ida Gold) от Тихоокеанского северо-западного фермерского кооператива, штат Вашингтон, США; (садовая кресс-салат) от Kelly Seed and Hardware Co., Пеория, Иллинойс, США, и Thlaspi arvense (полевая кресс-салат — Elizabeth) от USDA-ARS, Пеория, Иллинойс, США. Ни одно из использованных в исследовании семян не обрабатывалось пестицидами. Все семена были обработаны и использованы в данном исследовании в соответствии с местными и национальными нормами, а также в соответствии со всеми соответствующими местными, государственными и национальными правилами. В данном исследовании не рассматривались трансгенные сорта растений.
Семена Brassica juncea (PG), люцерны (Ls), белой горчицы (IG) и Thlaspi arvense (DFP) были измельчены в мелкий порошок с помощью ультрацентрифужной мельницы Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Германия), оснащенной сеткой 0,75 мм и ротором из нержавеющей стали, 12 зубьев, 10 000 об/мин (таблица 1). Измельченный порошок семян был перенесен в бумажный наперсток и обезжирен гексаном в аппарате Сокслета в течение 24 часов. Подвыборка обезжиренной полевой горчицы была подвергнута термической обработке при 100 °C в течение 1 часа для денатурации мирозиназы и предотвращения гидролиза глюкозинолатов с образованием биологически активных изотиоцианатов. Термически обработанный порошок семян хвоща (DFP-HT) использовался в качестве отрицательного контроля путем денатурации мирозиназы.
Содержание глюкозинолатов в обезжиренном семенном шроте определяли в трех повторениях с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в соответствии с ранее опубликованным протоколом 64. Кратко, к образцу обезжиренного семенного порошка массой 250 мг добавляли 3 мл метанола. Каждый образец подвергали ультразвуковой обработке в водяной бане в течение 30 минут и оставляли в темноте при 23°C на 16 часов. Затем 1 мл аликвоты органического слоя фильтровали через фильтр 0,45 мкм в автосамплер. Содержание глюкозинолатов в семенном шроте определяли в трех повторениях на системе ВЭЖХ Shimadzu (два насоса LC 20AD; автосамплер SIL 20A; дегазатор DGU 20As; УФ-детектор SPD-20A для мониторинга при 237 нм; и модуль коммуникационной шины CBM-20A). Использовалось программное обеспечение Shimadzu LC Solution версии 1.25 (Shimadzu Corporation, Колумбия, Мэриленд, США). Колонка представляла собой обращенно-фазовую колонку C18 Inertsil (250 мм × 4,6 мм; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Торранс, Калифорния, США). Начальные условия подвижной фазы были установлены на уровне 12% метанола/88% 0,01 М гидроксида тетрабутиламмония в воде (TBAH; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) со скоростью потока 1 мл/мин. После инъекции 15 мкл образца начальные условия поддерживались в течение 20 минут, затем соотношение растворителей было скорректировано до 100% метанола, общее время анализа образца составило 65 минут. Стандартная калибровочная кривая (на основе нМ/мАб) была построена путем серийных разведений свежеприготовленных стандартов синапина, глюкозинолатов и мирозина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) для оценки содержания серы в обезжиренной семенной муке. Концентрации глюкозинолатов в образцах определялись на ВЭЖХ-системе Agilent 1100 (Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США) с использованием программы OpenLAB CDS ChemStation версии (C.01.07 SR2 [255]), оснащенной той же колонкой, и с использованием ранее описанного метода. Концентрации глюкозинолатов определялись; результаты должны быть сопоставимы между системами ВЭЖХ.
Аллил изотиоцианат (94%, стабильный) и бензил изотиоцианат (98%) были приобретены у компании Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). 4-Гидроксибензилизотиоцианат был приобретен у компании ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, Калифорния, США). При ферментативном гидролизе мирозиназой глюкозинолаты, глюкозинолаты и глюкозинолаты образуют соответственно аллил изотиоцианат, бензил изотиоцианат и 4-гидроксибензилизотиоцианат.
Лабораторные биотесты проводились по методу Мутури и др. 32 с модификациями. В исследовании использовались пять низкожирных кормовых смесей из семян: DFP, DFP-HT, IG, PG и Ls. Двадцать личинок помещали в одноразовый трехходовой стакан объемом 400 мл (VWR International, LLC, Radnor, PA, USA), содержащий 120 мл деионизированной воды (dH2O). Для оценки токсичности для личинок комаров тестировали семь концентраций муки из семян: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 и 0,12 г муки из семян/120 мл dH2O для муки из семян DFP, DFP-HT, IG и PG. Предварительные биотесты показывают, что обезжиренная мука из семян Ls более токсична, чем четыре другие протестированные муки из семян. Поэтому мы скорректировали семь концентраций муки из семян Ls для различных вариантов обработки до следующих значений: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 и 0,075 г/120 мл дистиллированной воды.
Для оценки нормальной смертности насекомых в условиях эксперимента была включена контрольная группа без обработки (dH20, без добавления семенной муки). Токсикологические биотесты для каждой семенной муки включали три повтора в трехстаканных мерных стаканах (по 20 личинок поздней третьей стадии развития в каждом стакане), всего 108 пробирок. Обработанные контейнеры хранились при комнатной температуре (20-21°C), а смертность личинок регистрировалась в течение 24 и 72 часов непрерывного воздействия концентраций обработки. Если тело и конечности комара не двигаются при прокалывании или прикосновении тонким шпателем из нержавеющей стали, личинки комара считаются мертвыми. Мертвые личинки обычно остаются неподвижными в дорсальном или вентральном положении на дне контейнера или на поверхности воды. Эксперимент повторяли три раза в разные дни, используя разные группы личинок, всего 180 личинок, подвергнутых воздействию каждой концентрации обработки.
Токсичность AITC, BITC и 4-HBITC для личинок комаров оценивали с использованием одной и той же процедуры биотестирования, но с различными вариантами обработки. Для каждого химического вещества готовили исходные растворы с концентрацией 100 000 ppm, добавляя 100 мкл химического вещества к 900 мкл абсолютного этанола в центрифужную пробирку объемом 2 мл и встряхивая в течение 30 секунд для тщательного перемешивания. Концентрации для обработки определяли на основе наших предварительных биотестов, которые показали, что BITC значительно токсичнее, чем AITC и 4-HBITC. Для определения токсичности использовали 5 концентраций BITC (1, 3, 6, 9 и 12 ppm), 7 концентраций AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 и 35 ppm) и 6 концентраций 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 и 35 ppm). Контрольный образец обрабатывали 108 мкл абсолютного этанола, что эквивалентно максимальному объему химического реагента. Биологические анализы повторяли, как описано выше, подвергая воздействию в общей сложности 180 личинок на каждую концентрацию. Смертность личинок регистрировали для каждой концентрации AITC, BITC и 4-HBITC после 24 часов непрерывного воздействия.
Пробит-анализ 65 данных о смертности, зависящей от дозы, был выполнен с использованием программного обеспечения Polo (Polo Plus, LeOra Software, версия 1.0) для расчета 50% летальной концентрации (LC50), 90% летальной концентрации (LC90), наклона, коэффициента летальной дозы и 95% летальной концентрации. Расчеты проводились на основе доверительных интервалов для отношения летальных доз для логарифмически преобразованных концентраций и кривых зависимости смертности от дозы. Данные о смертности основаны на объединенных данных повторных измерений 180 личинок, подвергнутых воздействию каждой концентрации. Вероятностный анализ проводился отдельно для каждой муки из семян и каждого химического компонента. На основе 95% доверительного интервала отношения летальных доз токсичность муки из семян и химических компонентов для личинок комаров считалась существенно различной, поэтому доверительный интервал, содержащий значение 1, не являлся статистически значимым, P = 0,0566.
Результаты ВЭЖХ-анализа для определения основных глюкозинолатов в обезжиренной муке из семян DFP, IG, PG и Ls приведены в таблице 1. Содержание основных глюкозинолатов в исследованных образцах муки из семян варьировалось, за исключением DFP и PG, которые содержали глюкозинолаты мирозиназы. Содержание мирозинина в PG было выше, чем в DFP, составляя 33,3 ± 1,5 и 26,5 ± 0,9 мг/г соответственно. Порошок семян Ls содержал 36,6 ± 1,2 мг/г глюкогликона, тогда как порошок семян IG содержал 38,0 ± 0,5 мг/г синапина.
Личинки комаров Ae. Aedes aegypti погибали при обработке обезжиренной семенной мукой, хотя эффективность обработки варьировалась в зависимости от вида растения. Только DFP-NT не был токсичен для личинок комаров после 24 и 72 часов воздействия (таблица 2). Токсичность активного порошка семян возрастала с увеличением концентрации (рис. 1A, B). Токсичность семенной муки для личинок комаров значительно варьировалась в зависимости от 95% доверительного интервала отношения летальных доз значений LC50 при оценке через 24 и 72 часа (таблица 3). Через 24 часа токсический эффект семенной муки Ls был сильнее, чем при других обработках семенной мукой, с самой высокой активностью и максимальной токсичностью для личинок (LC50 = 0,04 г/120 мл dH2O). Личинки оказались менее чувствительны к DFP через 24 часа по сравнению с обработкой порошком семян IG, Ls и PG, при этом значения LC50 составили 0,115, 0,04 и 0,08 г/120 мл dH2O соответственно, что статистически значимо выше значения LC50 0,211 г/120 мл dH2O (таблица 3). Значения LC90 для DFP, IG, PG и Ls составили 0,376, 0,275, 0,137 и 0,074 г/120 мл dH2O соответственно (таблица 2). Самая высокая концентрация DPP составила 0,12 г/120 мл dH2O. После 24 часов оценки средняя смертность личинок составила всего 12%, в то время как средняя смертность личинок групп IG и PG достигла 51% и 82% соответственно. После 24 часов оценки средняя смертность личинок при самой высокой концентрации муки из семян Ls (0,075 г/120 мл dH2O) составила 99% (рис. 1А).
Кривые смертности были построены на основе зависимости доза-эффект (пробит) для личинок Ae. Egyptian (личинки 3-й стадии развития) от концентрации семенной муки через 24 часа (A) и 72 часа (B) после обработки. Пунктирная линия представляет собой LC50 обработки семенной мукой. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Термически инактивированная Thlaspi arvense, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
При 72-часовой оценке значения LC50 для DFP, IG и PG составили 0,111, 0,085 и 0,051 г/120 мл dH2O соответственно. Почти все личинки, подвергшиеся воздействию муки из семян Ls, погибли через 72 часа, поэтому данные о смертности не соответствуют результатам пробит-анализа. По сравнению с другими видами муки из семян, личинки были менее чувствительны к обработке мукой из семян DFP и имели статистически более высокие значения LC50 (таблицы 2 и 3). Через 72 часа значения LC50 для обработки мукой из семян DFP, IG и PG были оценены как 0,111, 0,085 и 0,05 г/120 мл dH2O соответственно. После 72 часов оценки значения LC90 для порошков семян DFP, IG и PG составили 0,215, 0,254 и 0,138 г/120 мл dH2O соответственно. После 72 часов оценки средняя смертность личинок при обработке мукой из семян DFP, IG и PG при максимальной концентрации 0,12 г/120 мл dH2O составила 58%, 66% и 96% соответственно (рис. 1B). После 72 часов оценки было установлено, что мука из семян PG более токсична, чем мука из семян IG и DFP.
Синтетические изотиоцианаты, аллил изотиоцианат (AITC), бензил изотиоцианат (BITC) и 4-гидроксибензилизотиоцианат (4-HBITC), эффективно уничтожают личинки комаров. Через 24 часа после обработки BITC оказался более токсичным для личинок со значением LC50 5,29 ppm по сравнению с 19,35 ppm для AITC и 55,41 ppm для 4-HBITC (таблица 4). По сравнению с AITC и BITC, 4-HBITC обладает меньшей токсичностью и более высоким значением LC50. Наблюдаются значительные различия в токсичности для личинок комаров двух основных изотиоцианатов (Ls и PG) в наиболее эффективном корме из семян. Токсичность, основанная на соотношении летальных доз LC50 между AITC, BITC и 4-HBITC, показала статистически значимую разницу, так что 95% доверительный интервал соотношения летальных доз LC50 не включал значение 1 (P = 0,05, Таблица 4). Было установлено, что самые высокие концентрации как BITC, так и AITC убивают 100% исследованных личинок (Рисунок 2).
Кривые смертности были построены на основе зависимости доза-эффект (пробит) для Ae. Через 24 часа после обработки египетские личинки (личинки 3-й стадии развития) достигли концентраций синтетического изотиоцианата. Пунктирная линия представляет собой LC50 для обработки изотиоцианатом. Бензил изотиоцианат BITC, аллил изотиоцианат AITC и 4-HBITC.
Использование растительных биопестицидов в качестве средств борьбы с комарами-переносчиками заболеваний изучается уже давно. Многие растения производят природные химические вещества, обладающие инсектицидной активностью37. Их биоактивные соединения представляют собой привлекательную альтернативу синтетическим инсектицидам и обладают большим потенциалом в борьбе с вредителями, включая комаров.
Горчичные растения выращивают ради семян, которые используются в качестве пряности и источника масла. При извлечении горчичного масла из семян или при извлечении горчицы для использования в качестве биотоплива, 69 побочным продуктом является обезжиренная мука из семян. Эта мука из семян сохраняет многие свои природные биохимические компоненты и гидролитические ферменты. Токсичность этой муки из семян объясняется образованием изотиоцианатов55,60,61. Изотиоцианаты образуются в результате гидролиза глюкозинолатов ферментом мирозиназой во время гидратации муки из семян38,55,70 и, как известно, обладают фунгицидным, бактерицидным, нематоцидным и инсектицидным действием, а также другими свойствами, включая химические сенсорные эффекты и химиотерапевтические свойства61,62,70. Несколько исследований показали, что горчичные растения и мука из семян эффективно действуют в качестве фумигантов против почвенных и хранящихся пищевых вредителей57,59,71,72. В данном исследовании мы оценили токсичность четырехкомпонентной муки из семян и трех ее биологически активных продуктов: AITC, BITC и 4-HBITC для личинок комаров рода Aedes (Aedes aegypti). Предполагается, что добавление муки из семян непосредственно в воду, содержащую личинки комаров, активирует ферментативные процессы, приводящие к образованию изотиоцианатов, токсичных для личинок комаров. Эта биотрансформация была частично продемонстрирована наблюдаемой ларвицидной активностью муки из семян и потерей инсектицидной активности при термической обработке муки из семян карликовой горчицы перед использованием. Предполагается, что термическая обработка разрушает гидролитические ферменты, активирующие глюкозинолаты, тем самым предотвращая образование биологически активных изотиоцианатов. Это первое исследование, подтверждающее инсектицидные свойства порошка из семян капусты против комаров в водной среде.
Среди протестированных порошков семян наиболее токсичным оказался порошок семян кресс-салата (Ls), вызывающий высокую смертность комаров Aedes albopictus. Личинки Aedes aegypti обрабатывались непрерывно в течение 24 часов. Остальные три порошка семян (PG, IG и DFP) обладали более медленной активностью и все еще вызывали значительную смертность после 72 часов непрерывной обработки. Только мука из семян Ls содержала значительное количество глюкозинолатов, тогда как PG и DFP содержали мирозиназу, а IG — глюкозинолат в качестве основного глюкозинолата (таблица 1). Глюкотропаеолин гидролизуется до BITC, а синальбин — до 4-HBITC61,62. Результаты наших биотестов показывают, что как мука из семян Ls, так и синтетический BITC обладают высокой токсичностью для личинок комаров. Основным компонентом муки из семян PG и DFP является глюкозинолат мирозиназы, который гидролизуется до AITC. AITC эффективно уничтожает личинки комаров со значением LC50 19,35 ppm. По сравнению с AITC и BITC, изотиоцианат 4-HBITC наименее токсичен для личинок. Хотя AITC менее токсичен, чем BITC, его значения LC50 ниже, чем у многих эфирных масел, протестированных на личинках комаров32,73,74,75.
Наш порошок из семян крестоцветных, предназначенный для борьбы с личинками комаров, содержит один основной глюкозинолат, составляющий более 98-99% от общего количества глюкозинолатов, как было определено методом ВЭЖХ. Были обнаружены следовые количества других глюкозинолатов, но их содержание составляло менее 0,3% от общего количества глюкозинолатов. Порошок из семян кресс-салата (L. sativum) содержит вторичные глюкозинолаты (синигрин), но их доля составляет 1% от общего количества глюкозинолатов, и их содержание все еще незначительно (около 0,4 мг/г порошка из семян). Хотя PG и DFP содержат один и тот же основной глюкозинолат (мирозин), ларвицидная активность их семян значительно различается из-за значений LC50. Различается токсичность для мучнистой росы. Появление личинок Aedes aegypti может быть связано с различиями в активности мирозиназы или стабильности двух кормовых смесей из семян. Активность мирозиназы играет важную роль в биодоступности продуктов гидролиза, таких как изотиоцианаты, в растениях семейства Brassicaceae76. Предыдущие исследования Покока и др.77 и Уилкинсона и др.78 показали, что изменения активности и стабильности мирозиназы могут быть также связаны с генетическими и экологическими факторами.
Ожидаемое содержание биоактивных изотиоцианатов было рассчитано на основе значений LC50 каждого вида муки из семян через 24 и 72 часа (таблица 5) для сравнения с соответствующими химическими обработками. Через 24 часа изотиоцианаты в муке из семян оказались более токсичными, чем чистые соединения. Значения LC50, рассчитанные на основе частей на миллион (ppm) изотиоцианатов в обработке семян, были ниже, чем значения LC50 для BITC, AITC и 4-HBITC. Мы наблюдали, как личинки поедают гранулы муки из семян (рисунок 3A). Следовательно, личинки могут получать более концентрированное воздействие токсичных изотиоцианатов, проглатывая гранулы муки из семян. Это наиболее ярко проявилось при обработке семян IG и PG в течение 24 часов, где концентрации LC50 были на 75% и 72% ниже, чем при обработке чистым AITC и 4-HBITC соответственно. Обработка Ls и DFP оказалась более токсичной, чем обработка чистым изотиоцианатом, со значениями LC50 на 24% и 41% ниже соответственно. Личинки в контрольной группе успешно окуклились (рис. 3B), в то время как большинство личинок в группе, обработанной семенами, не окуклились, и развитие личинок было значительно замедлено (рис. 3B,D). У Spodoptera litura изотиоцианаты связаны с замедлением роста и задержкой развития79.
Личинки комаров Ae. Aedes aegypti непрерывно подвергались воздействию порошка семян Brassica в течение 24–72 часов. (A) Мертвые личинки с частицами муки из семян в ротовом аппарате (обведены кружком); (B) Контрольный вариант (dH2O без добавления муки из семян) показывает, что личинки нормально развиваются и начинают окукливаться через 72 часа; (C, D) Личинки, обработанные мукой из семян; мука из семян показала различия в развитии и не окуклилась.
Мы не изучали механизм токсического действия изотиоцианатов на личинки комаров. Однако предыдущие исследования на рыжих огненных муравьях (Solenopsis invicta) показали, что основным механизмом биологической активности изотиоцианатов является ингибирование глутатион-S-трансферазы (GST) и эстеразы (EST), и AITC, даже при низкой активности, также может ингибировать активность GST у рыжих огненных муравьев в низких концентрациях. Доза составляет 0,5 мкг/мл80. В отличие от этого, AITC ингибирует ацетилхолинэстеразу у взрослых кукурузных долгоносиков (Sitophilus zeamais)81. Для выяснения механизма действия изотиоцианатов на личинки комаров необходимо провести аналогичные исследования.
Мы используем обработку DFP, инактивированную нагреванием, чтобы подтвердить предположение о том, что гидролиз растительных глюкозинолатов с образованием реактивных изотиоцианатов служит механизмом борьбы с личинками комаров с помощью муки из семян горчицы. Мука из семян DFP-HT не была токсична при протестированных нормах применения. Лафарга и др. 82 сообщили, что глюкозинолаты чувствительны к деградации при высоких температурах. Ожидается также, что термическая обработка денатурирует фермент мирозиназу в муке из семян и предотвращает гидролиз глюкозинолатов с образованием реактивных изотиоцианатов. Это также было подтверждено Окунаде и др. 75, показавшими, что мирозиназа чувствительна к температуре, продемонстрировав, что активность мирозиназы полностью инактивируется при воздействии температур выше 80°C на семена горчицы, черной горчицы и кровохлебки. Эти механизмы могут привести к потере инсектицидной активности термически обработанной муки из семян DFP.
Таким образом, жмых из семян горчицы и три его основных изотиоцианата токсичны для личинок комаров. Учитывая эти различия между жмыхом из семян и химическими препаратами, использование жмыха из семян может быть эффективным методом борьбы с комарами. Необходимо определить подходящие составы и эффективные системы доставки для повышения эффективности и стабильности использования порошков из семян. Наши результаты указывают на потенциальное использование жмыха из семян горчицы в качестве альтернативы синтетическим пестицидам. Эта технология может стать инновационным инструментом для борьбы с комарами-переносчиками заболеваний. Поскольку личинки комаров процветают в водной среде, а глюкозинолаты жмыха из семян ферментативно превращаются в активные изотиоцианаты при гидратации, использование жмыха из семян горчицы в зараженной комарами воде предлагает значительный потенциал контроля. Хотя ларвицидная активность изотиоцианатов варьируется (BITC > AITC > 4-HBITC), необходимы дополнительные исследования, чтобы определить, увеличивает ли синергизм токсичность при сочетании жмыха семян с несколькими глюкозинолатами. Это первое исследование, демонстрирующее инсектицидное действие обезжиренного жмыха семян крестоцветных и трех биоактивных изотиоцианатов на комаров. Результаты этого исследования открывают новые горизонты, показывая, что обезжиренный жмых семян капусты, побочный продукт экстракции масла из семян, может служить перспективным ларвицидным средством для борьбы с комарами. Эта информация может способствовать дальнейшему открытию растительных биоконтрольных агентов и их разработке в качестве дешевых, практичных и экологически чистых биопестицидов.
Сгенерированные для данного исследования наборы данных и полученные в результате анализы доступны у соответствующего автора по обоснованному запросу. По завершении исследования все использованные материалы (насекомые и семенная мука) были уничтожены.
Дата публикации: 29 июля 2024 г.