Чтобы эффективноборьба с комарамиДля снижения заболеваемости, переносимой ими, необходимы стратегические, устойчивые и экологически безопасные альтернативы химическим пестицидам. Мы оценили шроты из семян некоторых видов крестоцветных (семейство Brassica) как источник растительных изотиоцианатов, получаемых ферментативным гидролизом биологически неактивных глюкозинолатов, для использования в борьбе с египетским комаром Aedes (L., 1762). Пятиступенчатая обезжиренная мука из семян (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 и Thlaspi arvense – три основных типа термической инактивации и ферментативного распада Химические продукты Для определения токсичности (LC50) аллилизотиоцианата, бензилизотиоцианата и 4-гидроксибензилизотиоцианата для личинок Aedes aegypti при 24-часовом воздействии = 0,04 г/120 мл dH2O). Значения LC50 для горчицы, белой горчицы и хвоща. Содержание аллилизотиоцианата (LC50 = 19,35 ppm) в муке семян составило 0,05, 0,08 и 0,05 соответственно, а 4-гидроксибензилизотиоцианат (LC50 = 55,41 ppm) оказался более токсичным для личинок через 24 часа после обработки, чем 0,1 г/120 мл dH2O соответственно. Эти результаты согласуются с данными по производству муки из семян люцерны. Более высокая эффективность бензиловых эфиров соответствует расчетным значениям LC50. Использование муки из семян может обеспечить эффективный метод борьбы с комарами. Эффективность порошка из семян крестоцветных и его основных химических компонентов против личинок комаров и показывает, как природные соединения в порошке из семян крестоцветных могут служить перспективным экологически безопасным ларвицидом для борьбы с комарами.
Трансмиссивные заболевания, вызываемые комарами рода Aedes, остаются серьезной проблемой глобального общественного здравоохранения. Заболеваемость заболеваниями, переносимыми комарами, распространяется географически1,2,3 и возникает повторно, что приводит к вспышкам тяжелых заболеваний4,5,6,7. Распространение болезней среди людей и животных (например, лихорадки чикунгунья, денге, лихорадки Рифт-Валли, желтой лихорадки и вируса Зика) беспрецедентно. Одна только лихорадка денге подвергает риску заражения примерно 3,6 миллиарда человек в тропиках, причем, по оценкам, ежегодно происходит 390 миллионов случаев заражения, что приводит к 6100–24 300 смертям в год8. Повторное появление и вспышка вируса Зика в Южной Америке привлекли внимание всего мира из-за повреждения головного мозга, которое он вызывает у детей, рожденных инфицированными женщинами2. Кремер и др. 3 прогнозируют, что ареал распространения комаров Aedes будет продолжать расширяться и что к 2050 году половина населения мира подвергнется риску заражения арбовирусами, переносимыми комарами.
За исключением недавно разработанных вакцин против лихорадки денге и желтой лихорадки, вакцины против большинства заболеваний, переносимых комарами, до сих пор не разработаны9,10,11. Вакцины по-прежнему доступны в ограниченном количестве и используются только в клинических испытаниях. Борьба с комарами-переносчиками с помощью синтетических инсектицидов стала ключевой стратегией по контролю распространения заболеваний, переносимых комарами12,13. Хотя синтетические пестициды эффективны в уничтожении комаров, их дальнейшее использование негативно влияет на нецелевые организмы и загрязняет окружающую среду14,15,16. Еще более тревожной является тенденция к росту устойчивости комаров к химическим инсектицидам17,18,19. Эти проблемы, связанные с пестицидами, ускорили поиск эффективных и экологически безопасных альтернатив для борьбы с переносчиками болезней.
Различные растения были разработаны в качестве источников фитопестицидов для борьбы с вредителями20,21. Растительные вещества, как правило, являются экологически безопасными, поскольку они биоразлагаемы и обладают низкой или пренебрежимо малой токсичностью для нецелевых организмов, таких как млекопитающие, рыбы и земноводные20,22. Известно, что растительные препараты производят множество биоактивных соединений с различными механизмами действия для эффективного контроля различных стадий развития комаров23,24,25,26. Соединения растительного происхождения, такие как эфирные масла и другие активные растительные ингредиенты, привлекли внимание и проложили путь к созданию инновационных средств для борьбы с комарами-переносчиками. Эфирные масла, монотерпены и сесквитерпены действуют как репелленты, отпугиватели кормления и овициды27,28,29,30,31,32,33. Многие растительные масла вызывают гибель личинок, куколок и взрослых особей комаров34,35,36, поражая нервную, дыхательную, эндокринную и другие важные системы насекомых37.
Недавние исследования пролили свет на потенциальное использование растений горчицы и их семян в качестве источника биологически активных соединений. Мука из семян горчицы была испытана в качестве биофумиганта38,39,40,41 и использовалась в качестве почвенной добавки для подавления сорняков42,43,44 и контроля почвенных фитопатогенов45,46,47,48,49,50, питания растений, нематод41,51,52,53,54 и вредителей55,56,57,58,59,60. Фунгицидная активность этих порошков семян объясняется защитными соединениями растений, называемыми изотиоцианатами38,42,60. В растениях эти защитные соединения хранятся в растительных клетках в форме биологически неактивных глюкозинолатов. Однако при повреждении растений насекомыми или заражением патогенами глюкозинолаты гидролизуются мирозиназой до биоактивных изотиоцианатов55,61. Изотиоцианаты — это летучие соединения, обладающие широким спектром антимикробной и инсектицидной активности, и их структура, биологическая активность и содержание значительно различаются у разных видов семейства крестоцветных42,59,62,63.
Хотя известно, что изотиоцианаты, полученные из муки из семян горчицы, обладают инсектицидной активностью, данные о биологической активности против важных с медицинской точки зрения членистоногих переносчиков отсутствуют. В нашем исследовании изучалась ларвицидная активность четырех обезжиренных порошков семян против комаров Aedes. Личинки Aedes aegypti. Целью исследования была оценка их потенциального использования в качестве экологически чистых биопестицидов для борьбы с комарами. Три основных химических компонента муки из семян, аллилизотиоцианат (AITC), бензилизотиоцианат (BITC) и 4-гидроксибензилизотиоцианат (4-HBITC), также были протестированы для проверки биологической активности этих химических компонентов на личинках комаров. Это первый отчет, в котором оценивается эффективность четырех порошков из семян капусты и их основных химических компонентов против личинок комаров.
Лабораторные колонии Aedes aegypti (штамм Rockefeller) содержались при температуре 26 °C, относительной влажности (ОВ) 70 % и 10:14 ч (фотопериод L:D). Спарившихся самок содержали в пластиковых клетках (высотой 11 см и диаметром 9,5 см) и кормили через систему кормления из бутылочки цитратной бычьей кровью (HemoStat Laboratories Inc., Диксон, Калифорния, США). Кормление кровью осуществляли как обычно, используя мембранную многостеклянную кормушку (Chemglass, Life Sciences LLC, Винленд, Нью-Джерси, США), соединенную с циркуляционной водяной баней (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) с контролем температуры 37 °C. На дно каждой стеклянной кормушки (площадь 154 мм2) натянули пленку Parafilm M. Затем каждую кормушку помещали на верхнюю решетку, покрывающую клетку с спаривающейся самкой. Примерно 350–400 мкл бычьей крови добавляли в стеклянную воронку с помощью пипетки Пастера (Fisherbrand, Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) и взрослым червям давали стечь в течение как минимум одного часа. Затем беременным самкам давали 10% раствор сахарозы и позволяли откладывать яйца на влажную фильтровальную бумагу, выложенную в отдельные ультрапрозрачные чашки для суфле (размером 1,25 жидких унций, Dart Container Corp., Мейсон, Мичиган, США). клетку с водой. Поместите фильтровальную бумагу с яйцами в герметичный пакет (SC Johnsons, Расин, Висконсин) и храните при температуре 26 °C. Яйца вылуплялись, и примерно 200–250 личинок выращивали в пластиковых лотках, содержащих смесь кроличьего корма (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Мишн, Канзас, США) и печеночного порошка (MP Biomedicals, LLC, Солон, Огайо, США). и рыбное филе (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Германия) в соотношении 2:1:1. В наших биопробах использовались личинки поздней стадии третьего возраста.
Семенной материал растений, использованный в этом исследовании, был получен из следующих коммерческих и государственных источников: Brassica juncea (горчица сибирская - Pacific Gold) и Brassica juncea (горчица белая - Ida Gold) из фермерского кооператива Pacific Northwest, штат Вашингтон, США; (кресс-салат) из компании Kelly Seed and Hardware Co., г. Пеория, штат Иллинойс, США и Thlaspi arvense (ярутка полевая - Elisabeth) из службы сельскохозяйственных исследований Министерства сельского хозяйства США (USDA-ARS), г. Пеория, штат Иллинойс, США; Ни одно из семян, использованных в исследовании, не обрабатывалось пестицидами. Весь семенной материал был обработан и использован в этом исследовании в соответствии с местными и национальными правилами и с соблюдением всех соответствующих местных государственных и национальных правил. В этом исследовании не изучались трансгенные сорта растений.
Семена Brassica juncea (PG), Lufalfa (Ls), White Gord (IG), Thlaspi arvense (DFP) измельчали в мелкий порошок с использованием ультрацентрифужной мельницы Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Германия), оснащенной сеткой 0,75 мм и ротором из нержавеющей стали, 12 зубцами, 10 000 об/мин (таблица 1). Порошок из измельченных семян переносили в бумажный наперсток и обезжиривали гексаном в аппарате Сокслета в течение 24 ч. Часть обезжиренной горчицы полевой подвергали термической обработке при 100 °C в течение 1 ч для денатурации мирозиназы и предотвращения гидролиза глюкозинолатов с образованием биологически активных изотиоцианатов. Термообработанный порошок семян хвоща полевого (DFP-HT) использовали в качестве отрицательного контроля путем денатурации мирозиназы.
Содержание глюкозинолатов в обезжиренной семенной муке определяли в трех повторах с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в соответствии с ранее опубликованным протоколом 64 . Вкратце, 3 мл метанола добавляли к 250 мг образца обезжиренного семенного порошка. Каждый образец обрабатывали ультразвуком на водяной бане в течение 30 минут и оставляли в темноте при 23 °C на 16 часов. Затем аликвоту органического слоя объемом 1 мл фильтровали через фильтр с размером ячеек 0,45 мкм в автосэмплер. Работая на системе ВЭЖХ Shimadzu (два насоса LC 20AD; автосэмплер SIL 20A; дегазатор DGU 20As; детектор UV-VIS SPD-20A для мониторинга при 237 нм; и модуль коммуникационной шины CBM-20A), содержание глюкозинолатов в семенной муке определяли в трех повторах . Использовалось программное обеспечение Shimadzu LC Solution версии 1.25 (Shimadzu Corporation, Колумбия, Мэриленд, США). Колонка представляла собой обращенно-фазовую колонку C18 Inertsil (250 мм × 4,6 мм; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Торранс, Калифорния, США). Начальные условия подвижной фазы были установлены следующим образом: 12% метанол/88% 0,01 М раствор гидроксида тетрабутиламмония в воде (TBAH; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) со скоростью потока 1 мл/мин. После ввода 15 мкл образца начальные условия поддерживались в течение 20 минут, затем соотношение растворителей корректировалось до 100% метанола. Общее время анализа образца составило 65 минут. Стандартная кривая (на основе нМ/мАТ) была построена путем серийных разведений свежеприготовленных стандартов синапина, глюкозинолата и мирозина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, штат Миссури, США) для оценки содержания серы в обезжиренной зерновой муке. глюкозинолаты. Концентрации глюкозинолатов в образцах были исследованы на ВЭЖХ-системе Agilent 1100 (Agilent, Санта-Клара, штат Калифорния, США) с использованием версии OpenLAB CDS ChemStation (C.01.07 SR2 [255]), оснащенной той же колонкой, и с использованием ранее описанного метода. Концентрации глюкозинолатов были определены; результаты должны быть сопоставимы между системами ВЭЖХ.
Аллилизотиоцианат (94%, стабильный) и бензилизотиоцианат (98%) были приобретены у компании Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). 4-Гидроксибензилизотиоцианат был приобретен у компании ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, Калифорния, США). При ферментативном гидролизе мирозиназой глюкозинолаты, глюкозинолаты и глюкозинолаты образуют аллилизотиоцианат, бензилизотиоцианат и 4-гидроксибензилизотиоцианат соответственно.
Лабораторные биопробы проводились в соответствии с методом Мутури и соавторов 32 с модификациями. В исследовании использовались пять обезжиренных зерновых кормов: DFP, DFP-HT, IG, PG и Ls. Двадцать личинок помещали в одноразовый трехкомпонентный стакан объемом 400 мл (VWR International, LLC, Рэднор, Пенсильвания, США), содержащий 120 мл деионизированной воды (dH2O). Семь концентраций зерновой муки были протестированы на токсичность для личинок комаров: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 и 0,12 г зерновой муки/120 мл dH2O для муки из семян DFP, DFP-HT, IG и PG. Предварительные биопробы показывают, что обезжиренная мука из семян Ls более токсична, чем четыре других протестированных вида зерновой муки. Таким образом, мы скорректировали семь концентраций обработки муки из семян Ls до следующих концентраций: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 и 0,075 г/120 мл dH2O.
Необработанная контрольная группа (dH20, без добавки шрота) была включена для оценки нормальной смертности насекомых в условиях анализа. Токсикологические биопробы для каждого шрота включали три повторных трехскатных стакана (20 личинок поздней третьей стадии на стакан), в общей сложности 108 пробирок. Обработанные контейнеры хранили при комнатной температуре (20-21 °C), а смертность личинок регистрировали в течение 24 и 72 часов непрерывного воздействия концентраций обработки. Если тело и конечности комара не двигаются при прокалывании или прикосновении тонким шпателем из нержавеющей стали, личинки комара считаются мертвыми. Мертвые личинки обычно остаются неподвижными в дорсальном или вентральном положении на дне контейнера или на поверхности воды. Эксперимент повторяли три раза в разные дни с использованием разных групп личинок, в общей сложности 180 личинок, подвергнутых воздействию каждой концентрации обработки.
Токсичность AITC, BITC и 4-HBITC для личинок комаров оценивалась с помощью одной и той же процедуры биотестирования, но с использованием различных методов обработки. Для приготовления исходных растворов с концентрацией 100 000 ppm каждого химического вещества добавляли 100 мкл химического вещества к 900 мкл абсолютного этанола в центрифужной пробирке объёмом 2 мл и встряхивали в течение 30 секунд для тщательного перемешивания. Концентрации для обработки определялись на основе наших предварительных биотестов, которые показали, что BITC значительно более токсичен, чем AITC и 4-HBITC. Для определения токсичности были использованы 5 концентраций BITC (1, 3, 6, 9 и 12 ppm), 7 концентраций AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 и 35 ppm) и 6 концентраций 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 и 35 ppm). 30, 45, 60, 75 и 90 ppm. Контрольная обработка включала инъекцию 108 мкл абсолютного этанола, что эквивалентно максимальному объему химической обработки. Биопробы повторяли, как указано выше, подвергая воздействию в общей сложности 180 личинок на каждую концентрацию обработки. Смертность личинок регистрировали для каждой концентрации AITC, BITC и 4-HBITC после 24 часов непрерывного воздействия.
Пробит-анализ 65 данных о смертности, связанной с дозой, был выполнен с использованием программного обеспечения Polo (Polo Plus, LeOra Software, версия 1.0) для расчета 50% летальной концентрации (LC50), 90% летальной концентрации (LC90), наклона, коэффициента летальной дозы и 95% летальной концентрации. на основе доверительных интервалов для отношений летальных доз для логарифмически преобразованных кривых концентрации и дозы-смертности. Данные о смертности основаны на объединенных данных повторных испытаний 180 личинок, подвергшихся воздействию каждой концентрации обработки. Вероятностные анализы проводились отдельно для каждого вида муки из семян и каждого химического компонента. На основе 95% доверительного интервала отношения летальных доз токсичность муки из семян и химических компонентов для личинок комаров считалась существенно различной, поэтому доверительный интервал, содержащий значение 1, существенно не отличался, P = 0,0566.
Результаты ВЭЖХ определения основных глюкозинолатов в обезжиренной муке из семян DFP, IG, PG и Ls представлены в таблице 1. Содержание основных глюкозинолатов в исследованных образцах муки варьировалось, за исключением DFP и PG, которые оба содержали глюкозинолаты мирозиназы. Содержание мирозинина в PG было выше, чем в DFP, 33,3 ± 1,5 и 26,5 ± 0,9 мг/г соответственно. Порошок из семян Ls содержал 36,6 ± 1,2 мг/г глюкогликона, тогда как порошок из семян IG содержал 38,0 ± 0,5 мг/г синапина.
Личинки комаров Ae. Aedes aegypti погибали при обработке обезжиренной мукой из семян, хотя эффективность обработки варьировалась в зависимости от вида растения. Только DFP-NT не был токсичным для личинок комаров после 24 и 72 часов воздействия (таблица 2). Токсичность активного порошка семян увеличивалась с увеличением концентрации (рис. 1A, B). Токсичность муки из семян для личинок комаров значительно варьировалась на основе 95% ДИ летального соотношения доз значений LC50 при 24-часовой и 72-часовой оценках (таблица 3). Через 24 часа токсический эффект муки из семян Ls был больше, чем у других обработок мукой из семян, с самой высокой активностью и максимальной токсичностью для личинок (LC50 = 0,04 г/120 мл dH2O). Личинки были менее чувствительны к ДФП через 24 часа по сравнению с обработкой порошком семян ИГ, ЛС и ПГ, при этом значения ЛК50 составили 0,115, 0,04 и 0,08 г/120 мл dH2O соответственно, что статистически достоверно выше значения ЛК50. 0,211 г/120 мл dH2O (таблица 3). Значения ЛК90 для ДФП, ИГ, ПГ и ЛС составили 0,376, 0,275, 0,137 и 0,074 г/120 мл dH2O соответственно (таблица 2). Максимальная концентрация ДФП составила 0,12 г/120 мл dH2O. После 24 часов наблюдения средняя смертность личинок составила всего 12%, в то время как средняя смертность личинок IG и PG достигла 51% и 82% соответственно. После 24 часов наблюдения средняя смертность личинок при обработке самой высокой концентрацией муки из семян Ls (0,075 г/120 мл dH2O) составила 99% (рис. 1А).
Кривые смертности были рассчитаны на основе зависимости реакции от дозы (Probit) для личинок Ae. Egyptian (личинки 3-й стадии) на концентрацию шрота через 24 часа (A) и 72 часа (B) после обработки. Пунктирная линия представляет собой LC50 обработки шротом. DFP: Thlaspi arvense, DFP-HT: инактивированный нагреванием Thlaspi arvense, IG: Sinapsis alba (Ida Gold), PG: Brassica juncea (Pacific Gold), Ls: Lepidium sativum.
При 72-часовой оценке значения LC50 для шрота семян DFP, IG и PG составили 0,111, 0,085 и 0,051 г/120 мл dH2O соответственно. Почти все личинки, подвергшиеся воздействию шрота семян Ls, погибли через 72 часа воздействия, поэтому данные о смертности не согласуются с анализом Probit. По сравнению с другими шротами семян, личинки были менее чувствительны к обработке шротом семян DFP и имели статистически более высокие значения LC50 (таблицы 2 и 3). Через 72 часа значения LC50 для обработок шротом семян DFP, IG и PG составили 0,111, 0,085 и 0,05 г/120 мл dH2O соответственно. После 72 часов оценки значения LC90 для порошков семян DFP, IG и PG составили 0,215, 0,254 и 0,138 г/120 мл dH₂O соответственно. После 72 часов оценки средняя смертность личинок при обработке мукой из семян DFP, IG и PG при максимальной концентрации 0,12 г/120 мл dH₂O составила 58, 66 и 96% соответственно (рис. 1B). После 72 часов оценки было обнаружено, что мука из семян PG оказалась более токсичной, чем мука из семян IG и DFP.
Синтетические изотиоцианаты, аллилизотиоцианат (AITC), бензилизотиоцианат (BITC) и 4-гидроксибензилизотиоцианат (4-HBITC), способны эффективно уничтожать личинки комаров. Через 24 часа после обработки BITC был более токсичен для личинок со значением LC50 5,29 ppm по сравнению с 19,35 ppm для AITC и 55,41 ppm для 4-HBITC (таблица 4). По сравнению с AITC и BITC, 4-HBITC обладает меньшей токсичностью и более высоким значением LC50. Существуют значительные различия в токсичности для личинок комаров двух основных изотиоцианатов (Ls и PG) в наиболее сильнодействующей зерновой муке. Оценка токсичности, основанная на соотношении летальных доз LC50 для AITC, BITC и 4-HBITC, показала статистически значимую разницу, так что 95% доверительный интервал (ДИ) соотношения летальных доз LC50 не включал значение 1 (P = 0,05, таблица 4). По оценкам, максимальные концентрации как BITC, так и AITC убивали 100% исследованных личинок (рисунок 2).
Кривые смертности рассчитывались на основе зависимости эффекта дозы (Probit) для Ae. Через 24 часа после обработки египетские личинки (личинки 3-й стадии) достигли концентрации синтетического изотиоцианата. Пунктирная линия представляет собой LC50 для обработки изотиоцианатом. Бензилизотиоцианат (BITC), аллилизотиоцианат (AITC) и 4-HBITC.
Использование растительных биопестицидов для борьбы с комарами-переносчиками заболеваний изучается уже давно. Многие растения производят природные химические вещества, обладающие инсектицидной активностью37. Их биоактивные соединения представляют собой привлекательную альтернативу синтетическим инсектицидам и обладают большим потенциалом в борьбе с вредителями, включая комаров.
Горчица выращивается как сельскохозяйственная культура ради семян, используемых в качестве пряности и источника масла. При извлечении горчичного масла из семян или при извлечении горчицы для использования в качестве биотоплива69 побочным продуктом является обезжиренный шрот. Этот шрот сохраняет многие из своих природных биохимических компонентов и гидролитических ферментов. Токсичность этого шрота объясняется образованием изотиоцианатов55,60,61. Изотиоцианаты образуются путем гидролиза глюкозинолатов ферментом мирозиназой во время гидратации шрота38,55,70 и, как известно, обладают фунгицидным, бактерицидным, нематоцидным и инсектицидным действием, а также другими свойствами, включая химические сенсорные эффекты и химиотерапевтические свойства61,62,70. Несколько исследований показали, что растения горчицы и шрот действуют эффективно как фумиганты против вредителей почвы и запасов пищевых продуктов57,59,71,72. В этом исследовании мы оценили токсичность муки из четырех семян и ее трех биоактивных продуктов AITC, BITC и 4-HBITC для личинок комаров Aedes. Aedes aegypti. Ожидается, что добавление муки из семян непосредственно в воду, содержащую личинки комаров, активирует ферментативные процессы, которые производят изотиоцианаты, токсичные для личинок комаров. Эта биотрансформация была частично продемонстрирована наблюдаемой ларвицидной активностью муки из семян и потерей инсектицидной активности при термической обработке муки из семян горчицы карликовой перед использованием. Ожидается, что термическая обработка разрушает гидролитические ферменты, активирующие глюкозинолаты, тем самым предотвращая образование биоактивных изотиоцианатов. Это первое исследование, подтверждающее инсектицидные свойства порошка из семян капусты против комаров в водной среде.
Среди протестированных порошков семян, порошок семян кресс-салата (Ls) был наиболее токсичным, вызывая высокую смертность Aedes albopictus. Личинки Aedes aegypti обрабатывались непрерывно в течение 24 часов. Остальные три порошка семян (PG, IG и DFP) обладали более медленной активностью и все еще вызывали значительную смертность после 72 часов непрерывной обработки. Только мука из семян Ls содержала значительные количества глюкозинолатов, тогда как PG и DFP содержали мирозиназу, а IG содержал глюкозинолат в качестве основного глюкозинолата (таблица 1). Глюкотропеолин гидролизуется до BITC, а синальбин гидролизуется до 4-HBITC61,62. Результаты наших биоанализов показывают, что как мука из семян Ls, так и синтетический BITC являются высокотоксичными для личинок комаров. Основным компонентом муки из семян PG и DFP является глюкозинолат мирозиназы, который гидролизуется до AITC. AITC эффективен для уничтожения личинок комаров со значением LC50 19,35 ppm. По сравнению с AITC и BITC, изотиоцианат 4-HBITC наименее токсичен для личинок. Хотя AITC менее токсичен, чем BITC, его значения LC50 ниже, чем у многих эфирных масел, протестированных на личинках комаров32,73,74,75.
Наш порошок из семян крестоцветных, предназначенный для борьбы с личинками комаров, содержит один основной глюкозинолат, на долю которого приходится более 98–99 % от общего содержания глюкозинолатов, определяемого методом ВЭЖХ. Были обнаружены следовые количества других глюкозинолатов, но их содержание составило менее 0,3 % от общего содержания глюкозинолатов. Порошок из семян кресс-салата (L. sativum) содержит вторичные глюкозинолаты (синигрин), но их доля составляет 1 % от общего содержания глюкозинолатов, а их содержание по-прежнему незначительно (около 0,4 мг/г порошка). Хотя PG и DFP содержат один и тот же основной глюкозинолат (мирозин), ларвицидная активность их зерновых смесей существенно различается из-за значений LC50. Различается по токсичности для настоящей мучнистой росы. Появление личинок Aedes aegypti может быть связано с различиями в активности мирозиназы или стабильности двух видов корма. Активность мирозиназы играет важную роль в биодоступности продуктов гидролиза, таких как изотиоцианаты, в растениях семейства крестоцветных76. Предыдущие исследования Покока и соавторов77 и Уилкинсона и соавторов78 показали, что изменения активности и стабильности мирозиназы также могут быть связаны с генетическими и экологическими факторами.
Ожидаемое содержание биоактивных изотиоцианатов рассчитывалось на основе значений LC50 каждого вида шрота через 24 и 72 часа (таблица 5) для сравнения с соответствующими химическими обработками. Через 24 часа изотиоцианаты в шроте были более токсичны, чем чистые соединения. Значения LC50, рассчитанные на основе частей на миллион (ppm) изотиоцианатов для обработки семян, были ниже значений LC50 для BITC, AITC и 4-HBITC. Мы наблюдали, как личинки потребляли гранулы шрота (рисунок 3A). Следовательно, личинки могут получать более концентрированное воздействие токсичных изотиоцианатов при проглатывании гранул шрота. Это было наиболее очевидно при обработке мукой из семян IG и PG при 24-часовом воздействии, где концентрации LC50 были на 75% и 72% ниже, чем при обработке чистыми AITC и 4-HBITC соответственно. Обработки Ls и DFP были более токсичны, чем чистый изотиоцианат, со значениями LC50 на 24% и 41% ниже соответственно. Личинки в контрольной группе успешно окуклились (рис. 3B), в то время как большинство личинок в группе с мукой не окуклились, и развитие личинок было значительно задержано (рис. 3B, D). У Spodopteralitura изотиоцианаты связаны с задержкой роста и развития79.
Личинки комаров Ae. Aedes aegypti непрерывно подвергались воздействию порошка из семян Brassica в течение 24–72 часов. (A) Мертвые личинки с частицами муки из семян в ротовых частях (обведены); (B) Контрольная обработка (dH20 без добавления муки из семян) показывает, что личинки растут нормально и начинают окукливаться через 72 часа (C, D) Личинки, обработанные мукой из семян; мука из семян показала различия в развитии и не окуклилась.
Мы не изучали механизм токсического действия изотиоцианатов на личинки комаров. Однако предыдущие исследования на рыжих огненных муравьях (Solenopsis invicta) показали, что ингибирование глутатион-S-трансферазы (GST) и эстеразы (EST) является основным механизмом биологической активности изотиоцианата, а AITC, даже при низкой активности, также может ингибировать активность GST. [Предложение обрывается, требуется контекст]. ...
Мы используем обработку DFP с инактивацией нагреванием для подтверждения предположения о том, что гидролиз растительных глюкозинолатов с образованием реакционноспособных изотиоцианатов служит механизмом контроля личинок комаров с помощью муки из семян горчицы. Мука из семян DFP-HT оказалась нетоксичной при испытанных нормах внесения. Лафарга и соавторы 82 сообщили, что глюкозинолаты чувствительны к деградации при высоких температурах. Также ожидается, что тепловая обработка денатурирует фермент мирозиназу в муке из семян и предотвращает гидролиз глюкозинолатов с образованием реакционноспособных изотиоцианатов. Это также было подтверждено Окунаде и соавторами 75, показавшими, что мирозиназа чувствительна к температуре, показав, что активность мирозиназы полностью инактивировалась, когда семена горчицы, черной горчицы и лапчатки подвергались воздействию температур выше 80 ° C. Эти механизмы могут приводить к потере инсектицидной активности муки из семян DFP, подвергнутой тепловой обработке.
Таким образом, мука из семян горчицы и три ее основных изотиоцианата токсичны для личинок комаров. Учитывая эти различия между мукой из семян и химическими обработками, использование муки из семян горчицы может быть эффективным методом борьбы с комарами. Необходимо определить подходящие рецептуры и эффективные системы доставки для повышения эффективности и стабильности использования порошков из семян. Наши результаты указывают на потенциальное использование муки из семян горчицы в качестве альтернативы синтетическим пестицидам. Эта технология может стать инновационным инструментом для борьбы с комарами-переносчиками. Поскольку личинки комаров размножаются в водной среде, а глюкозинолаты муки из семян горчицы ферментативно превращаются в активные изотиоцианаты при гидратации, использование муки из семян горчицы в воде, зараженной комарами, обладает значительным потенциалом контроля. Хотя ларвицидная активность изотиоцианатов различна (BITC > AITC > 4-HBITC), необходимы дополнительные исследования, чтобы определить, приводит ли сочетание шрота семян с несколькими глюкозинолатами к синергетическому повышению токсичности. Это первое исследование, демонстрирующее инсектицидное действие обезжиренного шрота семян крестоцветных и трёх биоактивных изотиоцианатов на комаров. Результаты данного исследования открывают новые горизонты, показывая, что обезжиренный шрот семян капусты, побочный продукт экстракции масла из семян, может служить перспективным ларвицидным средством для борьбы с комарами. Эта информация может способствовать дальнейшему поиску агентов биологической борьбы с растениями и их разработке в качестве недорогих, практичных и экологически безопасных биопестицидов.
Наборы данных, полученные в ходе данного исследования, и результаты анализа доступны у соответствующего автора по обоснованному запросу. По окончании исследования все использованные материалы (насекомые и семенная мука) были уничтожены.
Время публикации: 29 июля 2024 г.