Для эффективногоборьба с комарамии снизить заболеваемость болезнями, которые они переносят, необходимы стратегические, устойчивые и экологически чистые альтернативы химическим пестицидам. Мы оценили муку из семян некоторых Brassicaceae (семейство Brassica) как источник изотиоцианатов растительного происхождения, полученных путем ферментативного гидролиза биологически неактивных глюкозинолатов для использования в борьбе с египетскими Aedes (L., 1762). Пятиступенчатая обезжиренная мука из семян (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 и Thlaspi arvense – три основных типа термической инактивации и ферментативной деградации Химические продукты Для определения токсичности (LC50) аллилизотиоцианата, бензилизотиоцианата и 4-гидроксибензилизотиоцианата для личинок Aedes aegypti при 24-часовом воздействии = 0,04 г/120 мл dH2O). Значения LC50 для горчицы, белой горчицы и хвоща. жмых семян составил 0,05, 0,08 и 0,05 соответственно по сравнению с аллилизотиоцианатом (LC50 = 19,35 ppm) и 4. -Гидроксибензилизотиоцианатом (LC50 = 55,41 ppm) был более токсичным для личинок через 24 часа после обработки, чем 0,1 г/120 мл dH2O соответственно. Эти результаты согласуются с производством жмыха семян люцерны. Более высокая эффективность бензиловых эфиров соответствует рассчитанным значениям LC50. Использование жмыха семян может обеспечить эффективный метод борьбы с комарами. эффективность порошка семян крестоцветных и его основных химических компонентов против личинок комаров и показывает, как природные соединения в порошке семян крестоцветных могут служить перспективным экологически чистым ларвицидом для борьбы с комарами.
Трансмиссивные заболевания, вызываемые комарами рода Aedes, остаются серьезной проблемой общественного здравоохранения в мире. Заболеваемость болезнями, переносимыми комарами, распространяется географически1,2,3 и возникает вновь, что приводит к вспышкам тяжелых заболеваний4,5,6,7. Распространение болезней среди людей и животных (например, чикунгунья, денге, лихорадка долины Рифт, желтая лихорадка и вирус Зика) беспрецедентно. Только лихорадка денге подвергает риску заражения около 3,6 миллиарда человек в тропиках, при этом ежегодно происходит около 390 миллионов случаев заражения, что приводит к 6 100–24 300 смертям в год8. Повторное появление и вспышка вируса Зика в Южной Америке привлекли внимание всего мира из-за повреждения мозга, которое он вызывает у детей, рожденных инфицированными женщинами2. Кремер и др. 3 прогнозируют, что ареал распространения комаров Aedes будет продолжать расширяться и что к 2050 году половина населения мира будет подвержена риску заражения арбовирусами, переносимыми комарами.
За исключением недавно разработанных вакцин против лихорадки денге и желтой лихорадки, вакцины против большинства заболеваний, переносимых комарами, еще не разработаны9,10,11. Вакцины по-прежнему доступны в ограниченном количестве и используются только в клинических испытаниях. Контроль над переносчиками заболеваний, переносимыми комарами, с помощью синтетических инсектицидов является ключевой стратегией по контролю распространения заболеваний, переносимых комарами12,13. Хотя синтетические пестициды эффективны для уничтожения комаров, постоянное использование синтетических пестицидов отрицательно влияет на нецелевые организмы и загрязняет окружающую среду14,15,16. Еще более тревожной является тенденция к повышению устойчивости комаров к химическим инсектицидам17,18,19. Эти проблемы, связанные с пестицидами, ускорили поиск эффективных и экологически безопасных альтернатив для контроля переносчиков заболеваний.
Различные растения были разработаны в качестве источников фитопестицидов для борьбы с вредителями20,21. Растительные вещества, как правило, являются экологически чистыми, поскольку они биоразлагаемы и имеют низкую или незначительную токсичность для нецелевых организмов, таких как млекопитающие, рыбы и земноводные20,22. Известно, что травяные препараты производят различные биоактивные соединения с различными механизмами действия для эффективного контроля различных стадий жизни комаров23,24,25,26. Растительные соединения, такие как эфирные масла и другие активные растительные ингредиенты, привлекли внимание и проложили путь для инновационных инструментов для контроля переносчиков комаров. Эфирные масла, монотерпены и сесквитерпены действуют как репелленты, отпугиватели кормления и овициды27,28,29,30,31,32,33. Многие растительные масла вызывают гибель личинок, куколок и взрослых особей комаров34,35,36, поражая нервную, дыхательную, эндокринную и другие важные системы насекомых37.
Недавние исследования дали представление о потенциальном использовании растений горчицы и их семян в качестве источника биологически активных соединений. Мука из семян горчицы была испытана в качестве биофумиганта38,39,40,41 и использовалась в качестве почвенной добавки для подавления сорняков42,43,44 и контроля почвенных патогенов растений45,46,47,48,49,50, питания растений. нематод41,51, 52, 53, 54 и вредителей55, 56, 57, 58, 59, 60. Фунгицидная активность этих порошков семян приписывается защитным соединениям растений, называемым изотиоцианатами38,42,60. В растениях эти защитные соединения хранятся в растительных клетках в форме небиологически активных глюкозинолатов. Однако, когда растения повреждаются насекомыми или патогенной инфекцией, глюкозинолаты гидролизуются мирозиназой в биоактивные изотиоцианаты55,61. Изотиоцианаты — это летучие соединения, известные своей широкой антимикробной и инсектицидной активностью, а их структура, биологическая активность и содержание сильно различаются среди видов Brassicaceae42,59,62,63.
Хотя известно, что изотиоцианаты, полученные из муки из семян горчицы, обладают инсектицидной активностью, данные о биологической активности против важных с медицинской точки зрения членистоногих переносчиков отсутствуют. В нашем исследовании изучалась ларвицидная активность четырех обезжиренных порошков семян против комаров Aedes. Личинки Aedes aegypti. Целью исследования была оценка их потенциального использования в качестве экологически чистых биопестицидов для борьбы с комарами. Три основных химических компонента муки из семян, аллилизотиоцианат (AITC), бензилизотиоцианат (BITC) и 4-гидроксибензилизотиоцианат (4-HBITC), также были протестированы для проверки биологической активности этих химических компонентов на личинках комаров. Это первый отчет, в котором оценивается эффективность четырех порошков семян капусты и их основных химических компонентов против личинок комаров.
Лабораторные колонии Aedes aegypti (штамм Рокфеллера) содержались при температуре 26°C, относительной влажности (RH) 70% и 10:14 ч (фотопериод L:D). Спаривающихся самок содержали в пластиковых клетках (высота 11 см и диаметр 9,5 см) и кормили через систему кормления из бутылочки с использованием цитратной бычьей крови (HemoStat Laboratories Inc., Диксон, Калифорния, США). Кормление кровью осуществлялось как обычно с использованием мембранного многостеклянного питателя (Chemglass, Life Sciences LLC, Винеленд, Нью-Джерси, США), соединенного с циркуляционной водяной баней (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) с контролем температуры 37 °C. Натяните пленку Parafilm M на дно каждой стеклянной камеры подачи (площадь 154 мм2). Затем каждую кормушку помещали на верхнюю решетку, покрывающую клетку, содержащую спаривающуюся самку. Примерно 350–400 мкл бычьей крови добавляли в стеклянную воронку с помощью пипетки Пастера (Fisherbrand, Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), и взрослым червям давали стечь в течение как минимум одного часа. Затем беременным самкам давали 10% раствор сахарозы и позволяли откладывать яйца на влажной фильтровальной бумаге, выложенной в отдельные ультрапрозрачные чашки для суфле (размером 1,25 жидких унций, Dart Container Corp., Мейсон, Мичиган, США). клетку с водой. Поместите фильтровальную бумагу с яйцами в герметичный пакет (SC Johnsons, Расин, Висконсин) и храните при температуре 26 °C. Яйца вылуплялись, и примерно 200–250 личинок выращивали в пластиковых лотках, содержащих смесь кроличьего корма (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Мишн, Канзас, США) и печеночного порошка (MP Biomedicals, LLC, Солон, Огайо, США). и филе рыбы (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Германия) в соотношении 2:1:1. В наших биопробах использовались личинки поздней третьей стадии.
Материал семян растений, использованный в этом исследовании, был получен из следующих коммерческих и государственных источников: Brassica juncea (горчица бурая - Pacific Gold) и Brassica juncea (горчица белая - Ida Gold) из Pacific Northwest Farmers' Cooperative, штат Вашингтон, США; (Садовый кресс) из Kelly Seed and Hardware Co., Пеория, Иллинойс, США и Thlaspi arvense (полевой ярутка - Elisabeth) из USDA-ARS, Пеория, Иллинойс, США; Ни одно из семян, использованных в исследовании, не было обработано пестицидами. Весь материал семян был обработан и использован в этом исследовании в соответствии с местными и национальными правилами и с соблюдением всех соответствующих местных государственных и национальных правил. В этом исследовании не изучались трансгенные сорта растений.
Семена Brassica juncea (PG), Alfalfa (Ls), White mountain (IG), Thlaspi arvense (DFP) измельчали до тонкого порошка с помощью ультрацентробежной мельницы Retsch ZM200 (Retsch, Haan, Германия), оснащенной сеткой 0,75 мм и ротором из нержавеющей стали, 12 зубцов, 10 000 об/мин (таблица 1). Измельченный порошок семян переносили в бумажный наперсток и обезжиривали гексаном в аппарате Сокслета в течение 24 ч. Часть образца обезжиренной полевой горчицы подвергали термической обработке при 100 °C в течение 1 ч для денатурации мирозиназы и предотвращения гидролиза глюкозинолатов с образованием биологически активных изотиоцианатов. Термообработанный порошок семян хвоща (DFP-HT) использовали в качестве отрицательного контроля путем денатурации мирозиназы.
Содержание глюкозинолатов в обезжиренной семенной муке определялось в трех повторностях с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в соответствии с ранее опубликованным протоколом 64 . Вкратце, 3 мл метанола добавляли к 250 мг образца обезжиренного семенного порошка. Каждый образец обрабатывали ультразвуком на водяной бане в течение 30 минут и оставляли в темноте при 23 °C на 16 часов. Затем аликвотную часть органического слоя объемом 1 мл фильтровали через фильтр 0,45 мкм в автосэмплер. Работая на системе ВЭЖХ Shimadzu (два насоса LC 20AD; автосэмплер SIL 20A; дегазатор DGU 20As; детектор UV-VIS SPD-20A для мониторинга при 237 нм; и модуль коммуникационной шины CBM-20A), содержание глюкозинолатов в семенной муке определяли в трех повторностях. с использованием программного обеспечения Shimadzu LC Solution версии 1.25 (Shimadzu Corporation, Колумбия, Мэриленд, США). Колонка представляла собой обращенно-фазовую колонку C18 Inertsil (250 мм × 4,6 мм; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Торранс, Калифорния, США). Начальные условия подвижной фазы были установлены на 12% метанола/88% 0,01 М гидроксида тетрабутиламмония в воде (TBAH; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) со скоростью потока 1 мл/мин. После инъекции 15 мкл образца начальные условия поддерживались в течение 20 минут, а затем соотношение растворителей было отрегулировано до 100% метанола, при этом общее время анализа образца составило 65 минут. Стандартная кривая (на основе нМ/мАТ) была получена путем серийных разведений свежеприготовленных стандартов синапина, глюкозинолата и мирозина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) для оценки содержания серы в обезжиренной муке из семян. глюкозинолаты. Концентрации глюкозинолатов в образцах были протестированы на Agilent 1100 HPLC (Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США) с использованием версии OpenLAB CDS ChemStation (C.01.07 SR2 [255]), оснащенной той же колонкой и с использованием ранее описанного метода. Концентрации глюкозинолатов были определены; быть сопоставимыми между системами HPLC.
Аллилизотиоцианат (94%, стабильный) и бензилизотиоцианат (98%) были приобретены у Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). 4-Гидроксибензилизотиоцианат был приобретен у ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, Калифорния, США). При ферментативном гидролизе мирозиназой глюкозинолаты, глюкозинолаты и глюкозинолаты образуют аллилизотиоцианат, бензилизотиоцианат и 4-гидроксибензилизотиоцианат соответственно.
Лабораторные биопробы проводились в соответствии с методом Мутури и др. 32 с модификациями. В исследовании использовались пять обезжиренных кормов из семян: DFP, DFP-HT, IG, PG и Ls. Двадцать личинок помещали в одноразовый трехкомпонентный стакан объемом 400 мл (VWR International, LLC, Radnor, PA, USA), содержащий 120 мл деионизированной воды (dH2O). Семь концентраций муки из семян были протестированы на токсичность для личинок комаров: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 и 0,12 г муки из семян/120 мл dH2O для муки из семян DFP, DFP-HT, IG и PG. Предварительные биопробы показывают, что обезжиренная мука из семян Ls более токсична, чем четыре других протестированных вида муки из семян. Поэтому мы скорректировали семь концентраций обработки муки из семян Ls до следующих концентраций: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 и 0,075 г/120 мл dH2O.
Необработанная контрольная группа (dH20, без добавки муки из семян) была включена для оценки нормальной смертности насекомых в условиях анализа. Токсикологические биопробы для каждой муки из семян включали три повторных трехскатных стакана (20 поздних личинок третьей стадии на стакан), всего 108 флаконов. Обработанные контейнеры хранились при комнатной температуре (20-21°C), а смертность личинок регистрировалась в течение 24 и 72 часов непрерывного воздействия концентраций обработки. Если тело и конечности комара не двигаются при прокалывании или прикосновении тонким шпателем из нержавеющей стали, личинки комара считаются мертвыми. Мертвые личинки обычно остаются неподвижными в дорсальном или вентральном положении на дне контейнера или на поверхности воды. Эксперимент повторяли три раза в разные дни с использованием разных групп личинок, всего 180 личинок подверглись воздействию каждой концентрации обработки.
Токсичность AITC, BITC и 4-HBITC для личинок комаров оценивалась с использованием той же процедуры биоанализа, но с разными обработками. Подготовьте 100 000 ppm исходных растворов для каждого химического вещества, добавив 100 мкл химического вещества к 900 мкл абсолютного этанола в центрифужной пробирке объемом 2 мл и встряхивая в течение 30 секунд для тщательного перемешивания. Концентрации обработки определялись на основе наших предварительных биоанализов, которые показали, что BITC намного более токсичен, чем AITC и 4-HBITC. Для определения токсичности использовали 5 концентраций BITC (1, 3, 6, 9 и 12 ppm), 7 концентраций AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 и 35 ppm) и 6 концентраций 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 и 35 ppm). 30, 45, 60, 75 и 90 ppm). Контрольная обработка была выполнена с использованием 108 мкл абсолютного этанола, что эквивалентно максимальному объему химической обработки. Биопробы были повторены, как указано выше, подвергая воздействию в общей сложности 180 личинок на концентрацию обработки. Смертность личинок регистрировалась для каждой концентрации AITC, BITC и 4-HBITC после 24 часов непрерывного воздействия.
Пробит-анализ 65 данных о смертности, связанной с дозой, был выполнен с использованием программного обеспечения Polo (Polo Plus, LeOra Software, версия 1.0) для расчета 50% летальной концентрации (LC50), 90% летальной концентрации (LC90), наклона, коэффициента летальной дозы и 95% летальной концентрации. на основе доверительных интервалов для соотношений летальных доз для логарифмически преобразованных кривых концентрации и дозы-смертности. Данные о смертности основаны на объединенных повторных данных 180 личинок, подвергшихся воздействию каждой концентрации обработки. Вероятностные анализы проводились отдельно для каждой муки из семян и каждого химического компонента. На основе 95% доверительного интервала соотношения летальных доз токсичность муки из семян и химических компонентов для личинок комаров считалась значительно различающейся, поэтому доверительный интервал, содержащий значение 1, существенно не отличался, P = 0,0566.
Результаты ВЭЖХ для определения основных глюкозинолатов в обезжиренной муке из семян DFP, IG, PG и Ls приведены в Таблице 1. Основные глюкозинолаты в исследованных образцах муки из семян различались, за исключением DFP и PG, которые оба содержали глюкозинолаты мирозиназы. Содержание мирозинина в PG было выше, чем в DFP, 33,3 ± 1,5 и 26,5 ± 0,9 мг/г соответственно. Порошок из семян Ls содержал 36,6 ± 1,2 мг/г глюкогликона, тогда как порошок из семян IG содержал 38,0 ± 0,5 мг/г синапина.
Личинки комаров Ae. Aedes aegypti погибали при обработке обезжиренной семенной мукой, хотя эффективность обработки варьировалась в зависимости от вида растения. Только DFP-NT не был токсичным для личинок комаров после 24 и 72 часов воздействия (таблица 2). Токсичность активного порошка семян увеличивалась с увеличением концентрации (рис. 1A, B). Токсичность семенной муки для личинок комаров значительно варьировалась на основе 95% ДИ летального соотношения доз значений LC50 при 24-часовой и 72-часовой оценках (таблица 3). Через 24 часа токсический эффект семенной муки Ls был больше, чем у других обработок семенной мукой, с самой высокой активностью и максимальной токсичностью для личинок (LC50 = 0,04 г/120 мл dH2O). Личинки были менее чувствительны к DFP через 24 часа по сравнению с обработками порошком семян IG, Ls и PG, при этом значения LC50 составили 0,115, 0,04 и 0,08 г/120 мл dH2O соответственно, что статистически выше значения LC50. 0,211 г/120 мл dH2O (таблица 3). Значения LC90 для DFP, IG, PG и Ls составили 0,376, 0,275, 0,137 и 0,074 г/120 мл dH2O соответственно (таблица 2). Самая высокая концентрация DPP составила 0,12 г/120 мл dH2O. После 24 часов оценки средняя смертность личинок составила всего 12%, в то время как средняя смертность личинок IG и PG достигла 51% и 82% соответственно. После 24 часов оценки средняя смертность личинок при самой высокой концентрации обработки шрота семян Ls (0,075 г/120 мл dH2O) составила 99% (рис. 1A).
Кривые смертности были рассчитаны на основе реакции на дозу (Probit) личинок Ae. Egyptian (личинки 3-й стадии) на концентрацию шрота через 24 часа (A) и 72 часа (B) после обработки. Пунктирная линия представляет LC50 обработки шротом. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Инактивированный нагреванием Thlaspi arvense, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
При 72-часовой оценке значения LC50 для муки из семян DFP, IG и PG составили 0,111, 0,085 и 0,051 г/120 мл dH2O соответственно. Почти все личинки, подвергшиеся воздействию муки из семян Ls, погибли через 72 часа воздействия, поэтому данные о смертности не соответствовали анализу Probit. По сравнению с другими видами муки из семян личинки были менее чувствительны к обработке мукой из семян DFP и имели статистически более высокие значения LC50 (таблицы 2 и 3). Через 72 часа значения LC50 для обработки мукой из семян DFP, IG и PG составили 0,111, 0,085 и 0,05 г/120 мл dH2O соответственно. После 72 часов оценки значения LC90 порошков семян DFP, IG и PG составили 0,215, 0,254 и 0,138 г/120 мл dH2O соответственно. После 72 часов оценки средняя смертность личинок при обработке мукой семян DFP, IG и PG при максимальной концентрации 0,12 г/120 мл dH2O составила 58%, 66% и 96% соответственно (рис. 1B). После 72 часов оценки было обнаружено, что мука семян PG более токсична, чем мука семян IG и DFP.
Синтетические изотиоцианаты, аллилизотиоцианат (AITC), бензилизотиоцианат (BITC) и 4-гидроксибензилизотиоцианат (4-HBITC) могут эффективно убивать личинки комаров. Через 24 часа после обработки BITC был более токсичен для личинок со значением LC50 5,29 ppm по сравнению с 19,35 ppm для AITC и 55,41 ppm для 4-HBITC (таблица 4). По сравнению с AITC и BITC, 4-HBITC имеет более низкую токсичность и более высокое значение LC50. Существуют значительные различия в токсичности для личинок комаров двух основных изотиоцианатов (Ls и PG) в самой мощной муке из семян. Токсичность, основанная на соотношении летальных доз значений LC50 между AITC, BITC и 4-HBITC, показала статистическую разницу, такую, что 95% ДИ соотношения летальных доз LC50 не включало значение 1 (P = 0,05, Таблица 4). По оценкам, самые высокие концентрации как BITC, так и AITC убивали 100% протестированных личинок (Рисунок 2).
Кривые смертности оценивались по дозозависимой зависимости (Probit) Ae. Через 24 часа после обработки египетские личинки (личинки 3-й стадии) достигли концентраций синтетического изотиоцианата. Пунктирная линия представляет собой LC50 для обработки изотиоцианатом. Бензилизотиоцианат BITC, аллилизотиоцианат AITC и 4-HBITC.
Использование растительных биопестицидов в качестве агентов по борьбе с переносчиками комаров давно изучается. Многие растения производят натуральные химикаты, обладающие инсектицидной активностью37. Их биоактивные соединения представляют собой привлекательную альтернативу синтетическим инсектицидам с большим потенциалом в борьбе с вредителями, включая комаров.
Растения горчицы выращиваются как культура для получения семян, используемых в качестве специи и источника масла. Когда горчичное масло извлекается из семян или когда горчица извлекается для использования в качестве биотоплива,69 побочным продуктом является обезжиренная мука из семян. Эта мука из семян сохраняет многие из своих природных биохимических компонентов и гидролитических ферментов. Токсичность этой муки из семян объясняется образованием изотиоцианатов55,60,61. Изотиоцианаты образуются путем гидролиза глюкозинолатов ферментом мирозиназой во время гидратации муки из семян38,55,70 и, как известно, обладают фунгицидным, бактерицидным, нематоцидным и инсектицидным действием, а также другими свойствами, включая химические сенсорные эффекты и химиотерапевтические свойства61,62,70. Несколько исследований показали, что растения горчицы и мука из семян действуют эффективно как фумиганты против вредителей почвы и запасов пищевых продуктов57,59,71,72. В этом исследовании мы оценили токсичность муки из четырех семян и ее трех биоактивных продуктов AITC, BITC и 4-HBITC для личинок комаров Aedes. Aedes aegypti. Добавление муки из семян непосредственно в воду, содержащую личинки комаров, как ожидается, активирует ферментативные процессы, которые производят изотиоцианаты, токсичные для личинок комаров. Эта биотрансформация была частично продемонстрирована наблюдаемой ларвицидной активностью муки из семян и потерей инсектицидной активности, когда мука из семян горчицы карликовой подвергалась термической обработке перед использованием. Ожидается, что термическая обработка разрушит гидролитические ферменты, которые активируют глюкозинолаты, тем самым предотвращая образование биоактивных изотиоцианатов. Это первое исследование, подтверждающее инсектицидные свойства порошка семян капусты против комаров в водной среде.
Среди протестированных порошков семян порошок из семян кресс-салата (Ls) оказался наиболее токсичным, вызвав высокую смертность Aedes albopictus. Личинки Aedes aegypti обрабатывались непрерывно в течение 24 часов. Остальные три порошка семян (PG, IG и DFP) имели более медленную активность и все равно вызывали значительную смертность после 72 часов непрерывной обработки. Только мука из семян Ls содержала значительные количества глюкозинолатов, тогда как PG и DFP содержали мирозиназу, а IG содержал глюкозинолат в качестве основного глюкозинолата (таблица 1). Глюкотропеолин гидролизуется до BITC, а синальбин гидролизуется до 4-HBITC61,62. Результаты наших биоанализов показывают, что как мука из семян Ls, так и синтетический BITC являются высокотоксичными для личинок комаров. Основным компонентом муки из семян PG и DFP является глюкозинолат мирозиназы, который гидролизуется до AITC. AITC эффективен в уничтожении личинок комаров со значением LC50 19,35 ppm. По сравнению с AITC и BITC, изотиоцианат 4-HBITC наименее токсичен для личинок. Хотя AITC менее токсичен, чем BITC, их значения LC50 ниже, чем у многих эфирных масел, протестированных на личинках комаров32,73,74,75.
Наш порошок из семян крестоцветных для использования против личинок комаров содержит один основной глюкозинолат, на который приходится более 98-99% от общего количества глюкозинолатов, как определено с помощью ВЭЖХ. Были обнаружены следовые количества других глюкозинолатов, но их уровни были менее 0,3% от общего количества глюкозинолатов. Порошок из семян кресс-салата (L. sativum) содержит вторичные глюкозинолаты (синигрин), но их доля составляет 1% от общего количества глюкозинолатов, и их содержание все еще незначительно (около 0,4 мг/г порошка семян). Хотя PG и DFP содержат один и тот же основной глюкозинолат (мирозин), ларвицидная активность их семян значительно различается из-за их значений LC50. Различается по токсичности для мучнистой росы. Появление личинок Aedes aegypti может быть связано с различиями в активности мирозиназы или стабильности между двумя видами семян. Активность мирозиназы играет важную роль в биодоступности продуктов гидролиза, таких как изотиоцианаты в растениях семейства капустных76. Предыдущие отчеты Покока и др.77 и Уилкинсона и др.78 показали, что изменения активности и стабильности мирозиназы также могут быть связаны с генетическими и экологическими факторами.
Ожидаемое биоактивное содержание изотиоцианата рассчитывалось на основе значений LC50 каждого вида муки из семян через 24 и 72 часа (таблица 5) для сравнения с соответствующими химическими применениями. Через 24 часа изотиоцианаты в муке из семян были более токсичными, чем чистые соединения. Значения LC50, рассчитанные на основе частей на миллион (ppm) обработок семян изотиоцианатом, были ниже значений LC50 для применений BITC, AITC и 4-HBITC. Мы наблюдали, как личинки потребляют гранулы муки из семян (рисунок 3A). Следовательно, личинки могут получать более концентрированное воздействие токсичных изотиоцианатов, проглатывая гранулы муки из семян. Это было наиболее очевидно при обработке IG и PG мукой семян при 24-часовом воздействии, где концентрации LC50 были на 75% и 72% ниже, чем при обработке чистыми AITC и 4-HBITC соответственно. Обработки Ls и DFP были более токсичными, чем чистый изотиоцианат, со значениями LC50 на 24% и 41% ниже соответственно. Личинки в контрольной обработке успешно окуклились (рис. 3B), в то время как большинство личинок в обработке мукой семян не окуклились, и развитие личинок было значительно задержано (рис. 3B,D). У Spodopteralitura изотиоцианаты связаны с задержкой роста и развития79.
Личинки комаров Ae. Aedes aegypti непрерывно подвергались воздействию порошка семян Brassica в течение 24–72 часов. (A) Мертвые личинки с частицами муки из семян в ротовых частях (обведены); (B) Контрольная обработка (dH20 без добавления муки из семян) показывает, что личинки растут нормально и начинают окукливаться через 72 часа (C, D) Личинки, обработанные мукой из семян; мука из семян показала различия в развитии и не окуклилась.
Мы не изучали механизм токсического воздействия изотиоцианатов на личинки комаров. Однако предыдущие исследования на красных огненных муравьях (Solenopsis invicta) показали, что ингибирование глутатион-S-трансферазы (GST) и эстеразы (EST) является основным механизмом биоактивности изотиоцианата, а AITC, даже при низкой активности, также может ингибировать активность GST. красных импортированных огненных муравьев в низких концентрациях. Доза составляет 0,5 мкг/мл80. Напротив, AITC ингибирует ацетилхолинэстеразу у взрослых кукурузных долгоносиков (Sitophilus zeamais)81. Аналогичные исследования должны быть проведены для выяснения механизма активности изотиоцианата у личинок комаров.
Мы используем обработку DFP с инактивацией нагреванием для поддержки предложения о том, что гидролиз растительных глюкозинолатов с образованием реактивных изотиоцианатов служит механизмом контроля личинок комаров с помощью муки из семян горчицы. Мука из семян DFP-HT не была токсичной при испытанных нормах внесения. Лафарга и др. 82 сообщили, что глюкозинолаты чувствительны к деградации при высоких температурах. Также ожидается, что тепловая обработка денатурирует фермент мирозиназу в муке из семян и предотвращает гидролиз глюкозинолатов с образованием реактивных изотиоцианатов. Это также подтвердили Окунаде и др. 75, показавшие, что мирозиназа чувствительна к температуре, показав, что активность мирозиназы полностью инактивировалась, когда семена горчицы, черной горчицы и лапчатки подвергались воздействию температур выше 80° C. Эти механизмы могут привести к потере инсектицидной активности муки из семян DFP, подвергнутой тепловой обработке.
Таким образом, мука из семян горчицы и ее три основных изотиоцианата токсичны для личинок комаров. Учитывая эти различия между мукой из семян и химической обработкой, использование муки из семян может быть эффективным методом борьбы с комарами. Необходимо определить подходящие рецептуры и эффективные системы доставки для повышения эффективности и стабильности использования порошков из семян. Наши результаты указывают на потенциальное использование муки из семян горчицы в качестве альтернативы синтетическим пестицидам. Эта технология может стать инновационным инструментом для борьбы с переносчиками-комарами. Поскольку личинки комаров процветают в водной среде, а глюкозинолаты муки из семян ферментативно преобразуются в активные изотиоцианаты при гидратации, использование муки из семян горчицы в воде, зараженной комарами, предлагает значительный потенциал контроля. Хотя ларвицидная активность изотиоцианатов варьируется (BITC > AITC > 4-HBITC), необходимы дополнительные исследования, чтобы определить, приводит ли объединение муки из семян с несколькими глюкозинолатами к синергическому повышению токсичности. Это первое исследование, демонстрирующее инсектицидное действие обезжиренной муки из семян крестоцветных и трех биоактивных изотиоцианатов на комаров. Результаты этого исследования открывают новые горизонты, показывая, что обезжиренная мука из семян капусты, побочный продукт извлечения масла из семян, может служить перспективным ларвицидным средством для борьбы с комарами. Эта информация может помочь в дальнейшем открытии агентов биоконтроля растений и их разработке в качестве дешевых, практичных и экологически чистых биопестицидов.
Наборы данных, созданные для этого исследования, и полученные анализы доступны у соответствующего автора по обоснованному запросу. По окончании исследования все материалы, использованные в исследовании (насекомые и мука из семян), были уничтожены.
Время публикации: 29 июля 2024 г.